I. Nguyên tắc: Có nhiều phương pháp sử dụng cho tách chiết DNA/RNA, ở Đây chúng tôi chọn phương pháp có thể sử dụng chung cho cả DNA và RNA nhằm tiết kiệm thời gian và đơn giản thao tác cho người thực hiện. Việc tách chiết DNA/RNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại protein, (3) tủa DNA/RNA.

Để thu nhận DNA/RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Trong tách chiết RNA cần lưu ý: RNA là phân tử kém bền nên ñể có kết quả tốt nhất, việc thao tác phải thực hiện trong những điều kiện nghiêm ngặt: Lạnh, mang găng tay, thao tác trong tủ cấy vô trùng…

Các hóa chất dùng trong quy trình tách chiết là :

1. phenol, guanidine thiocyanate có trong thành phần dung dịch Trizol là những chất biến tính protein mạnh (trong đó có Dnase, Rnase lần lượt là enzyme phân hủy DNA, RNA và các protein khác ảnh hưởng đến phản ứng PCR), phenol không hòa tan nucleic acid, khi xử lí với hai hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein…
2. chloroform: thường đi kèm với phenol, có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol, chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol.

Sau khi ly tâm, mẫu xử lí với Trizol sẽ phân tách thành hai lớp: Lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa DNA (khi Trizol có pH8) hoặc RNA (khi Trizol có pH4, Trizol pH4 hấp thụ DNA vào pha phenol), phần protein bị biến tính sẽ nằm ở bề mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ. DNA/RNA trong phần dịch nổi ở trên sẽ ñược thu nhận bằng cách tủa với isopropanol có bổ sung chất trợ tủa.

Chất trợ tủa là 1 loại polymer có cấu trúc mạng lưới nên dễ dàng bắt được các phân tử DNA/RNA, nhưng không ức chế phản ứng PCR. Trong điều kiện có chất trợ tủa, quá trình tủa có thể xảy ra ở nhiệt độ phòng với thời gian ngắn (khoảng 10 phút), nếu không có chất trợ tủa, quá trình tủa phải được thực hiện ở -20oC hoặc -70oC trong ít nhất 1 giờ.
DNA/RNA sau khi tủa sẽ được tủa và rửa lại 1 lần nữa với ethenol 70% và cuối cùng sẽ ñược bảo quản trong TE 1X nếu là DNA (Tris trong TE có vai trò ổn định pH và EDTA bắt các ion Mg2+ làm cho Dnase không có khả năng hoạt động) hoặc nước cất 2 lần đã xử lý với DEPC nếu là RNA (DEPC – Diethylpyrocarbonate là chất biến tính Rnase).

Có hai kiểu tủa chính:

a. Tủa bằng ethanol: được thực hiện ở nồng độ muối cao, nồng độ ethanol cao (2-2.5 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa), nhiệt độ thấp thúc đẩy sự tủa.
 b. Tủa bằng isopropanol: Khác kiểu tủa trên là không cần muối, có thể sử dụng 0.8-1 thể tích isopropanol/thể tích dung dịch cần tủa, những đoạn DNA/RNA thật ngắn dù ở nồng độ cao cũng không tủa bằng cách này nên có thể loại bỏ chúng dễ dàng.

II. Vật liệu – Hóa chất:
Dung dịch 1 (Trizol): Phenol 38%, guanidium thyocianate 0.8M, glycerol 5%, chỉnh về pH 8.0 (nếu dùng cho DNA) hoặc pH 4.0 (nếu dùng cho RNA).

Dung dịch 2: Chloroform.

Dung dịch 3: Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa. Dung dịch 4: Ethanol 70%. Dung dịch 5: Dung dịch TE 1X (Tris 0.1M – EDTA 0.001M).

3. Dụng cụ – Thiết bị: Pipetman 1000µl, 200µl, và cácñầu tip tương ứng. Eppendorf 1.5ml (nếu sử dụng cho tách chiết RNA phải dùng ñầu tip biopure có phin lọc và eppendorf biopure). Máy ly tâm. Máy vortex (lắc rung). Máy ủ nhiệt khô.



Phương pháp tách chiết DNA bằng cột


Spin Column

Tham khảo thêm hóa chất sinh học phân tử, bộ tách chiết tinh sạch RNA, dung dịch bảo quản mẫu RNAlater

SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com