Miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence: IF) là kĩ thuật sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực sinh học để phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của các kháng nguyên đó. Kỹ thuật này dựa theo nguyên lý các chất huỳnh quang được thêm vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể cho phép phát hiện kháng nguyên bằng các kĩ thuật huỳnh quang như kính hiển vi huỳnh quang, máy quét huỳnh quang.
Hai chất phát huỳnh quang sửa dụng phổ biến trong kĩ thuật này là Fluorescein isothiocyanate (FITC) và Tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) có thể gắn kết với các kháng thể mà không ảnh hưởng tới hoạt tính của kháng thể.
Fluorescein isothiocyanate (FITC) khi bị kích thích bởi tia UV, FITC phát quang thành ánh sáng màu xanh lá ở bước sóng 450 – 520 nm. Được dùng trong hai phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp, sử dụng cho kỹ thuật Flow Cytometry (ngưng kết dòng chảy) - một kĩ thuật phổ biến trong xác định bản chất dòng tế bào, điều trị một số bệnh về máu, tủy xương
Tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC): là chất phát huỳnh quang màu đỏ cam. Khi bị kích thích bởi tia UV sẽ phát huỳnh quang ở bước sóng từ 520 đến 800 nm.
Hai phương pháp chính trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang:
Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct Immunoflorescein DIF) - kháng thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác dụng với kháng nguyên.
Kháng thể trực tiếp đáp ứng với kháng nguyên như vi khuẩn hay virus. Mô hoặc các phết chứa vi sinh được gắn lên phiến kính và được ủ với kháng thể đã đánh dấu với thuốc nhuộm huỳnh quang. Sau đó rửa để loại bỏ những kháng thể không được bắt cặp. Kiểm tra dưới kính hiển vi ánh sáng UV, các kháng nguyên gắn với kháng thể sẽ phát sáng cho phép phát hiện vi khuẩn với số lượng thấp.
Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunofluorescein IIF): kháng thể (KT1) cho tác dụng trực tiếp với kháng nguyên, sau đó kháng thể thứ 2 (KT2) – kháng thể globulin đã được gắn với chất nhuộm huỳnh quang kết hợp vào KT1.
Kỹ thuật gián tiếp dùng để xác định kháng thể trong các dịch huyết thanh, huyết tương, dịch bọng nước hoặc xác định kháng nguyên trong các mô, môi trường tế bào. Mẫu chứa kháng thể, kháng nguyên được gắn lên phiến kính, sau đó được ủ với huyết thanh nghi ngờ chứa kháng thể, kháng nguyên đó. Huyết thanh sẽ được rửa, chỉ để lại kháng thể đặc hiệu kết hợp với kháng nguyên và đươc phát hiện khi ủ với kháng thể globulin đã được đánh dấu huỳnh quang. Sau đó rửa các kháng thể globulin không gắn kết rồi đem kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát hiện sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh.
Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp phát quang sáng hơn so với trực tiếp do từng phân tử kháng thể kết hợp với kháng nguyên sẽ bắt cặp với một vài phân tử kháng globulin nên huỳnh quang phát ra sẽ rõ hơn so với trực tiếp.
Ứng dụng thực tế của miễn dịch huỳnh quang trong chuẩn đoán các bệnh lý liên quan đến vi sinh như phân tích các kháng nguyên trong các mẫu mô tươi, mô đông lạnh, quan sát vi khuẩn hoặc kí sinh trùng.
Ngoài ra sử dụng phát hiện sự hiện diện các trình tự DNA chuyên biệt trên nhiễm sắc thể - gen dấu vết trong các bệnh di truyền.
Nguồn tham khảo: Chapter 10 | Immunofluorescence J. Paul Robinson PhD, Jennifer Sturgis BS and George L. Kumar PhD
Nguyễn Thị Mỹ Duyên- SBC Scientific