Hướng dẫn tối ưu hoá phản ứng PCR, nhằm làm tiết kiệm thời gian và công sức của người thiết kế thí nghiệm. PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử, mục đích để tạo ra nhiều bản sao từ một đoạn DNA trong ống nghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống.
Melting and Annealing Temperatures
Nhà cung cấp cặp mồi oligo sẽ cung cấp thông tin nhiệt độ nóng chảy (Tm) trong tài liệu mà họ gửi kèm với oligo. Tuy nhiên, các công ty khác nhau có Tm khác nhau, phụ thuộc vào phép tính mà họ sử dụng. Công cụ OligoAnalyzer trên trang web IDT thực sự hữu ích khi xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu để thiết lập các chu kì PCR của bạn. Bạn cũng có thể tự tính nhiệt độ nóng cháy bằng công thức sau:
Tm = 2(A + T) + 4(G+C)
Tm là nhiệt độ nóng chảy( melting); Ta là nhiệt độ gắn mồi
Trong đó: A, T, G, X bằng với số lượng của mỗi bazơ nitơ này trong trình tự mồi.
Nhiệt độ nóng chảy chịu ảnh hưởng bởi nồng độ muối đệm , pH, và nồng độ mồi, nhưng điều này không đáng lo ngại. Kiểm tra lại rằng bất kì cấu trúc bậc hai không mong muốn nào đều có nhiệt độ nóng chảy dưới nhiệt độ gắn mồi lí tưởng (Ta) (tối thiểu thấp hơn 10oC) đáng kể. Điều này sẽ ngăn chặn bản thân các oligo khỏi sự khuếch đại trong PCR. Công cụ OligoAnalyzez cũng sẽ kiểm tra sự có mặt bất kì cấu trúc bậc hai nào khi thiết kế các oligo.
Nhiệt độ gắn mồi nên được đặt dưới mức nhiệt độ nóng chảy thấp nhất của mồi là 3oC . Ví dụ, nếu mồi xuôi của bạn có Tm là 62oCvà mồi ngược có Tm là 61oC, đề nghị với Ta là 58oC.
Khu thực hiện chu trình nhiệt với chức năng gradient và bạn có đủ lượng khuôn mẫu để cài đặt PCR nhân 2 hoặc 3 lần, nên thử khoảng nhiệt độ gắn mồi và đánh giá Ta nào cung cấp kết quả tốt nhất.
Sử dụng Touchdown PCR
Với phương pháp touchdown PCR, trong đó một vài chu kì phản ứng PCR ban đầu được đặt ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn, Sau đó sẽ được giảm 1-2oC qua mỗi chu kì. Kỹ thuật này sẽ đưọc giải thích rõ hơn một chút.
Sử dụng ví dụ ở trên với nhiệt độ nóng chảy là 62oCvà 61oC, sẽ cài đặt Ta ở hai chu kì đầu là 63oC, hai chu kì kế tiếp là 62oC và sau đó là 61oC, 60oCvà 59oC với tổng cộng 10 chu kì. Tiếp theo, tôi sẽ thực hiện 25 chu kì tại 58oC. Ưu điểm của kĩ thuật này là các chu kì đầu tiên sẽ rất nghiêm ngặt, vì vậy rất khó xảy ra sự khuếch đại không đặc hiệu. Do đó, khi nhiệt độ gắn mồi trở dễ chấp nhận hơn, sẽ có một bể các sản phẩm khuếch đại mong muốn của bạn để cạnh tranh với bất kì trình tự không đặc hiệu cho việc gắn các mồi của bạn.
Hãy đảm bảo chu trình nhiệt của bạn thay đổi nhiệt độ một cách chính xác và hiệu quả. Một tín hiệu về chu trình nhiệt của bạn có lẽ không hoạt động chính xác là phản ứng diễn ra lâu hơn so với bình thường. Bạn có thể đảm bảo mọi thứ là đang hoạt động đơn giản bằng cách bao gồm một mẫu đối chứng với mỗi lần chạy (ví dụ: mồi, khuôn, điều kiện đệm mà bạn xác nhận trước đó).
DNA template
Sử dụng khuôn hay template có chất lương cao. Ngoài ra, sử dụng quá nhiều DNA sẽ làm giảm độ đặc hiệu phản ứng và làm tăng sự khuếch đại các sản phẩm không mong muốn. Bởi vì phản ứng PCR rất nhạy, thử sử dụng mẫu DNA ít nhất có thể. Bắt đầu với không quá 1 ng mẫu DNA cho khuôn plasmid , 10-40 ng cho mẫu cDNA hoặc lên tới 1 ug đối với các mẫu genomic DNA.
Extension time
Thời gian biến tính và gắn mồi không đổi, giai đoạn extension có thay đổi tuỳ theo kích cỡ đoạn DNA mà bạn muốn nhân lên. Quy tắc chung là cho phép thời gian kéo dài là 60 giây cho mỗi đoạn khuếch đại có kích thước 1 kb. Lấy ví dụ, nếu bạn khuếch đại một đoạn 2 kb, bạn sẽ set up thời gian kéo dài là 120 giây trên mỗi chu kì. Đoạn ngắn thì extension time ngắn. Đối với sản phẩm khuếch đại 200 bp, thời gian kéo dài từ 15 đến 20 giây là ok. Extention time quá lâu sẽ cho ra sản phẩm không mong muốn.
Chọn lựa enzyme polymerase
Enzyme Taq DNA Polymease hay được sử dụng cho phản ứng PCR. Enzyme Pyrococcus furiosus (PFU) polymerase sẽ cho tỉ lệ sai sót thấp hơn so với enzyme Taq polymerase. Tuy nhiên, các enzyme khác nhau hoạt động hiệu quả đối với các khuôn khác nhau.
Các thành phân đệm (buffers)
Khi mua enzyme polymerase, thường sẽ có buffer kèm theo. Nên theo protocol của nhà sản xuất, các hãng như
Sigma-Aldrich hoặc Bioline có hướng dẫn kèm theo khi mua. Tuy nhiên, điều quan trọng đó là để hiểu các thành phần của đệm và sự đóng góp của chúng tới hiệu quả PCR. Hầu hết các đệm là một sự kết hợp đơn giản của muối- như KCl và Mg2Cl2 tại một điểm pH tối ưu.
Magie
Nồng độ magie có thể được xử lý để cho phản ứng PCR hiệu quả và tính chính xác. Đối với Taq DNA polymerase nồng độ magie tối ưu từ 1.5 đến 2 µM. Bởi vì các thành phần phản ứng và đệm có thể giữ magie, vì thế điều cần thiết là tăng nồng độ magie. Khi biến đổi nồng độ này, cần có các sự điều chỉnh nhỏ (xấp xỉ sự bổ sung là 0.5 µM )
Primers
Tối ưu nồng độ mồi trong PCR rất quan trọng. Nếu bạn thêm quá nhiều mồi, sẽ làm tăng khả năng liên kết không đặc hiệu hoặc thậm chí bắt cặp lẫn nhau. Quy luật chung, nồng độ mồi tổng số thường ở mức 1 uM. Để tăng độ đặc hiệu, có thể giảm xuống thấp ở mức 0.1 uM, tuy nhiên điều này có thể làm giảm hiệu suất PCR.
dNTPs
Nồng độ của cac deoxynucleotides (dNTPs) ảnh hưởng tới cả độ đặc hiệu và năng suất của PCR. Nồng độ dNTP quá cao sẽ làm giảm độ đặc hiệu, trong khi quá thấp sẽ làm giảm hiệu suất. Nếu bạn quan tâm đến độ đặc hiệu hơn là hiệu suất thì: sử dụng nồng độ dNTP 50 µM cho hầu hết các phản ứng. Tuy nhiên, bạn có thể tăng nồng độ lên tới 200µM để tăng hiệu suất.
Có thể bạn quan tâm:
1.
Hoá chất sinh học phân tử
2.
Thiết bị sinh học phân tử
3.
Cách hiệu chuẩn pipet
4.
Kỹ thuật điện di
5.
Phương pháp tách chiết DNA/RNA
Thông tin liên hệ:
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com