R. Das, M. F. Hasan, M. S. Hossain và M. Rahman *

Khoa Di truyền học và Công nghệ sinh học 

Đại học Rajshahi, Rajshahi-6205, Bangladesh
 

Việc tái sinh chồi số lượng lớn loài rau má Centella asiatica L. đã đạt được thành công từ phần ngọn nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 4.0 mg/L BAP + 0.1 mg/L NAA. Trung bình có 10.2 ± 0.38 chồi sinh ra trên mỗi mẫu vật. Các chồi tái sinh ra rễ trên môi trường MS bổ sung 1.0 mg/L IBA. Các cây con được nuôi cấy in vitro đã được cho thích nghi khí hậu và đem trồng  hành công trong điều kiện tự nhiên với tỷ lệ sống sót 80%. Một quy trình tái sinh đã được thiết lập thành công cho việc nhân giống in vitro thông qua phát sinh chồi loài rau má Centella asiatica L. một loại thảo dược quan trọng có giá trị y học cao.
 

Từ khóa: Vi nhân giống, đỉnh chồi, Centella asiatica
 

Centella asiatica L. là một loại thảo dược có giá trị thuộc họ Apiaceae. Nó được phân bố khắp các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới như Bangladesh, Ấn Độ và Srilanka. Tại Bangladesh loài thực vật này được biết đến như là Thankuni (Huq, 1986). Đây là một loại thảo mộc lâu năm với thân rỗng hoặc đặc, lá xen kẽ, hoa đính quanh bầu, nhỏ, hoa lưỡng tính hoặc chỉ có hoa đực, thường thấy ở nơi ẩm ướt (Oyedeji và Afolayan, 2005). Các cây này có tính chống bệnh phong, trị giun chỉ, gây chán ăn, tăng sức đề kháng, kháng virut, kháng khuẩn (Gurib-Fakin và cộng sự, 1997) và chống khối u (Babu và cộng sự, 1995). Nó cũng được báo cáo là có chất diệt côn trùng (Stuart, 1982) và các đặc tính gây biến đổi gen (Yen và cộng sự, 2001). Loại cây này có chứa một số saponin triterpene là asiaticoside, sapogenins, axit asiatic, axit madecassic, adecassoside, vellarin, glycosides và centelloside (Duke và Ayensu, 1985; Glasby, 1991). Nó giàu các khoáng chất như canxi, magiê, kali, phốt pho và nhôm (Herbert và cộng sự, 1994, Brinkhaus và cộng sự, 2000). Nó được sử dụng để điều trị bệnh phong, vết thương, ung thư, sốt, bệnh giang mai, mụn trứng cá, dị ứng (Inamdar và cộng sự, 1996) áp xe, nhức đầu, hen, viêm phế quản, long đờm, co giật, kiết lỵ, eczema, bệnh lậu, cao huyết áp, vàng da, viêm màng phổi , thấp khớp, co thắt, lao phổi, loét và viêm niệu đạo (Hausen, 1993). Nó cũng đã được sử dụng như thuốc bổ não, là nguồn tái tạo tâm lý-vật lý và như là máy lọc máu (Jorge and Jorge, 2005).
 

Do nhu cầu sử dụng cây C. asiatica ở Bangladesh hiện nay được đáp ứng dựa vào các quần thể tự nhiên, dẫn đến sự suy giảm dần của chúng. Kỹ thuật nuôi cấy mô có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc nhân giống nhanh chóng các dòng có đặc tính ưu việt và bảo tồn nguồn gen C. asiatica.
 

Hơn nữa, một nguồn cung cấp ổn định các sản phẩm sinh học tích cực đã trở thành ưu tiên hàng đầu. Hơn nữa, có rất nhiều ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến cây thuốc quan trọng này mà việc chuẩn hóa một quy trình tái tạo in vitro hiệu quả là một điều kiện tiên quyết quan trọng. Sự tái sinh thực vật in vitro đã được báo cáo cho C. asiatica thông qua nuôi cấy mô sẹo từ các lá mầm (Banerjee và cộng sự, 1999), từ thân có mang mắt ngủ (Hossain và cộng sự, 2000) và qua sinh phôi soma (Martin, 2004). Trong bài báo này, chúng tôi mô tả một quy trình để tái tạo cây với số lượng lớn từ ngọn.
 

Đối với nghiên cứu này, phần ngọn của rau má Centella asiatica đã được thu thập từ khuôn viên Đại học Rajshahi, Bangladesh. Chúng được rửa dưới nước máy trong 30 phút và được xử lý với 1% Tween 80 trong 10 phút sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng. Xử lý xa hơn đã được thực hiện dưới điều kiện vô trùng trong tủ cấy. Mẫu vật được khử trùng bề mặt với 0.1% (W/V) HgCl2 trong 10 phút. Cuối cùng, các mẫu được rửa sạch vài lần với nước cất vô trùng để loại bỏ dư lượng của chất khử trùng. Ngọn được được cắt thành kích thước thích hợp và nuôi cấy trên môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962). Tất cả các thí nghiệm đều sử dụng  môi trường MS có 3% (W/V) sucrose và 0.8% (W/V) agar. pH của tất cả các môi trường đã được điều chỉnh đến 5.8 trước khi hấp khử trùng. Các môi trường nuôi cấy trong phòng nuôi cấy ở 25 ± 20oC với thời gian chiếu sáng 16 giờ ở cường độ ánh sáng 3000 lux được cung cấp bởi các đèn huỳnh quang màu trắng lạnh. Môi trường MS được bổ sung với BAP (1.0 - 7.0 mg/L) và NAA (0.1 mg/L). Các chồi mới cho ra rễ trên toàn bộ môi trường MS bổ sung với IBA ở các nồng độ khác nhau. Các cây con đã được phát triển tốt đã được lấy ra từ các bình nuôi, rửa nhẹ nhàng dưới vòi nước và được đặt trong chậu nhựa chứa hỗn hợp cát, đất và phân chuồng trại tỷ lệ 1: 1: 1. Các cây con trong chậu được phủ bằng tấm polythene để duy trì độ ẩm phù hợp. Sau khi đủ làm quen với khí hậu, cây trồng đã được trồng ở điều kiện đồng ruộng, và có 80% cây còn sống sót.
 

Sự nhân chồi từ ngọn của loài rau má Centella asiatica với số lượng lớn đã thành công. Loài cây này có khả năng phát triển trực tiếp nhiều chồi trên môi trường MS có chứa nồng độ khác nhau của auxin và cytokinin và sự kết hợp của chúng. Tỷ lệ cao nhất của nhân chồi là 76.67% trên môi trường MS với 4.0 mg/L BAP + 0.1 mg/L NAA (Hình A, Bảng 1), tiếp theo là 70.00% trên môi trường chứa 3.0 mg/L BAP và 0.1 mg/L NAA. Tỷ lệ nhân chồi thấp nhất là 10.00% trên môi trường MS bổ sung 7.0 mg/L BAP và 0.1 mg/L NAA. Số lượng chồi cao nhất là 10.2 ± 0.38 trên mỗi mẫu vật cấy trên môi trường MS có 4.0 mg/L BAP và 0.1 mg/L NAA (Bảng 1; hình B-C), tiếp theo là 8.0 ± 0.38 chồi trên mỗi cấy trong môi trường MS với 3.0 mgl -1 BAP + 0.1 mg/L NAA. Ngược lại, số lượng chồi ít nhất là 1.1 ± 0.20 trên mỗi mẫu vật cấy trên môi trường MS bổ sung với 1.0 mg/L BAP và 0.1 mg/L NAA. Các chồi phát triển dài ra trong cùng một môi trường. Trong nghiên cứu này, môi trường MS bổ sung 4.0 mg/L BAP + 0.1 mg/L NAA là nghiệm thức tốt nhất cho cảm ứng nhân chồi nhiều nhất nhất cũng như số lượng chồi trên mỗi mẫu vật. Kết quả tương tự cũng đã được báo cáo ở một số cây thuốc như Smilax zeylanica L. (Sayeed Hasan và Roy, 2004); Celastrus paniculatus (Martin và cộng sự, 2006); Heracleum candicans (Wakhlu và Sharma, 1998); Spilanthes mauritiana (Bais và cộng sự, 2002); Coleus blumei (Rani và cộng sự, 2006).
 

Bảng 1. Ảnh hưởng của BAP và NAA lên sự kích thích nhân chồi từ ngọn của rau má Centella asiatica

	Nồng độ hormone (mg/L)		% phản hồi	Số pượng chồi/mẫu vật	Shoot length (cm)
	BAP	NAA		(M ± SE)	(M ± SE)
	1.0	0.1	23.33	1.1 ± 0.20	0.78 ± 0.04
	2.0	0.1	36.67	3.1 ± 0.20	1.1 ± 0.07
	3.0	0.1	70.00	8.0 ± 0.38	1.9 ± 0.06
	4.0	0.1	76.67	10.2 ± 0.38	2.3 ± 0.12
	5.0	0.1	53.33	6.2 ± 0.28	1.5 ± 0.10
	6.0	0.1	33.33	4.4 ± 0.06	1.3 ± 0.07
	7.0	0.1	10.00	1.93 ± 0.23	0.91 ± 0.04

 

Mỗi giá trị đại diện cho trung bình 10 lần lặp lại và mỗi lần thử nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần, M = Trung bình, SE = sai số chuẩn
 

Các chồi phát triển tốt đã được phân lập và nuôi cấy trên môi trường MS có nồng độ khác nhau của IBA để kích thích sự phát triển của rễ. Tỉ lệ ra rễ cao nhất là 90.00% trên môi trường MS với 1.0 mg/L IBA (Hình D, Bảng 2), 73.33% đối với môi trường với 1.5 mg/L IBA. Tỷ lệ ra rễ thấp nhất là 10.00% trên môi trường bổ sung với 3.0 mg/L IBA. Số rễ nhiều nhất trên mỗi chồi là 10.6 ± 0.93 so với môi trường bổ sung thêm 1.0 mg/L IBA, tiếp theo là 8.2 ± 0.96 rễ/chồi trên môi trường có 1.5 mg/L IBA. Ngược lại, số lượng rễ cây ít nhất trên mỗi chồi là 0.8 ± 0.06 trong môi trường có 3.0 mg/L IBA. Từ đó cho thấy 1.0 mg/L IBA là nồng độ lý  tưởng cho cảm ứng ra rễ. Kết quả tương tự cũng được báo cáo ở một số cây thuốc khác, như Eclipta Alba (Baskaran và Jayabalan, 2005); Heracleum candicans (Wakhlu và Sharma, 1998); Plumbaga zeylanica (Chaplot và cộng sự, 2006), Cassia alata (Hasan và cộng sự, 2008) và Solanum trilobatum (Jawahar và cộng sự, 2004).
 

Sau 40 ngày, thu được các cây đã ra rễ khỏe mạnh. Sau đó, cây con được lấy ra từ các bình nuôi, rửa nhẹ nhàng dưới vòi nước và trồng trong chậu có chứa hỗn hợp cát, đất và phân chuồng trong tỷ lệ 1: 1: 1. Các cây con chậu được phủ bằng tấm polythene trong suốt để duy trì độ ẩm thích hợp. Sau khi làm quen với khí hậu, cây con được trồng trong điều kiện tự nhiên, và có 80% cây sống sót. Trong thí nghiệm này, một quy trình hiệu quả đã được thiết lập thông qua việc nhân nhiều chồi từ phần ngọn cây. Quy trình này có thể được khai thác để sử dụng trong thương mại và bảo tồn các nguồn tài nguyên cây thuốc có giá trị.
 

Bảng 2. Ảnh hưởng của IBA lên sự ra rễ của chồi tái sinh
 

	IBA	% ra rễ	Số lượng rễ/chồi	Chiều dài rễ (cm)
	(mg/L)		(M ± SE)	(M ± SE)
	0.5	56.67	6.30 ± 0.46	4.09 ± 0.10
	1.0	90.00	10.6 ± 0.93	4.30 ± 0.03
	1.5	73.33	8.20 ± 0.96	4.20 ± 0.07
	2.0	36.67	4.37 ± 0.22	4.05 ± 0.10
	2.5	26.67	2.50 ± 0.23	3.70 ± 0.10
	3.0	10.00	0.8 ± 0.06	2.90 ± 0.04

Mỗi giá trị đại diện cho trung bình 10 lần lặp lại và mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần, M = Trung bình, SE = sai số chuẩn

 

 

Hình 1. Vi nhân giống Centella asiatica bằng ngọn. A. Mọc nhiều chồi trên MS + 4.0 mg/L BAP + 0.1 mg/L NAA, B-C. Sự kéo dài của các cành in vitro trên cùng một môi trường, D. Chồi ra rễ in vitro trên MS + 1.0 mg/L IBA, E-F. Tập thích nghi khí hậu cho cây tái sinh trong ống nghiệm đến trồng trong điều kiện tự nhiên

Các tác giả muốn cảm ơn Khoa Di truyền học và Công nghệ sinh học, Đại học Rajshahi, để cung cấp hỗ trợ tài chính và các cơ sở phòng thí nghiệm để tiến hành nghiên cứu này.
 

Babu, T. D., Kuttan, G. and Padikkala, J. 1995. Cytotoxic and anti-tumour properties of certain taxa of Umbelliferae with special reference to Centella asiatica (L) Urban. J. Ethnopharmacol., 48: 53-57.

Bais, H. P., Green, J. B., Walker, T, S., Okemo, P. O. and Vivanco, J. M. 2002. In vitro propagation of Spilanthes mauritiana DC., an endangered medicinal herb through axillary bud cultures. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 38: 598–601.

Banerjee, S., Zehra, M. and Kumar, S. 1999. In vitro multiplication of Centella asiatica a medicinal herb from leaf explants. Curr. Sci., 76: 147-148.

Baskaran, P. and Jayabalan, N. 2005. An Efficient Micropropagation System for Eclipta Alba – A Valuable Medicinal Herb. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 41: 532–539.

Brinkhaus, B., Lindner, M., Schuppan, D., Ilahn, E. G. 2000. Chemical, pharmalogical and clinical profile of the East Asian medical plant Centella asiatica. Phytomedicine, 7(5): 427-428.

Chaplot, B. B., Dave, A. M. and Jasrai, Y. T. 2006. A valued medicinal plant-Chitrak (Plumbaga zeylanica Linn.): Successful plant regeneration through various explants and field performance. Plant Tiss. Cult. Biotechnol., 16(2): 77-84.

Duke, J. A. and Ayensu, E. S. 1985. Medicinal Plant of China. Reference Publication. Michigan., pp. 1–458.

Glasby, J. S. 1991. Dictionary of Plants Containing Secondary Metabolites. Taylor and Francis.

London.

Gurib-Fakin, A., Gueho, J. and Sewraj-Bissoondoyal, M. 1997. Int. J. Pharmacognosy, 35: 244.

Hasan, M. F., Das, R., Rahman, M. S., Hossain, M. S. and Rahman, M. 2008. Micropropagation from shoot tips and nodal segments of Cassia alata L. Intl. J. Bio. Res., 4(4): 70-74.

Hausen, B. M. 1993. Centella asiatica (Indian Pennywort), an Effective Therapeutic but a Weak Sensitizer. Contact Dermatitis., 29(4): 175-79.

Herbert, D., Paramasivan, C. N., Prabhakar, R. and Swaminanthan, G. 1994. In vitro experiments with Centella asiatica, investigation to elucidate the effect of an indigenously prepared powder of this plant on the acid-fastness and viability of Mycobacterium tuberculosis. Indian J. Lepr., 66: 65-68.

Hossain, S. N., Rahman, S., Joydhar, A., Islam, S. and Hossain, M. 2000. In vitro Propagation of Thankuni (Centella asiatica L.). Plant Tissue Cult., 10(1): 17-23.

Huq, A. M. 1986. Plant Names of Bangladesh (Native & Scientific). Bangladesh National Herbarium (BARC), 229, Green Road, Dhanmondi, Dhaka. p.26

Inamdar, P. K., Yeole, R. D., Ghogare, A. B. and De Souza, N. J. 1996. Determination of biologically active constituents in Centella asiatica. J. Chromatography, 742: 127-130.

Jawahar, M., Rebert, G. A. and Jeyaseelan, M. 2004. Rapid Proliferation of Multiple Shoots in Solanum trilobatum L. Plant Tissue Cult., 14(2): 107-112.

Jorge, O. A. and Jorge, A. D. 2005. Hepatotoxicity associated with the ingestion of Centella asiatica. Revista Espanola De Enfermedades Digestivas., 97(2): 115-124.

Martin, G., Geetha, S. P., Raja, S. S., Raghu, A. V., Balachandran, I. and Ravindran, P. N. 2006. An efficient micropropagation system for Celastrus paniculatus Willd. : A vulnerable medicinal plant. J. For. Res., 11: 461–465.

Martin, K. P. 2004. Plant regeneration through somatic embryogenesis in medicinally important Centella asiatica L. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant., 40: 586-591.

Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant., 15: 473-497.

Oyedeji, O. A. and Afolayan, A. J. 2005. Chemical Composition and Antibacterial Activity of the Essential Oil of Centella asiatica Growing in South Africa. Pharmaceutical Biol., 43(3): 249-252.

Rani, G., Talwar, D., Nagpal, A. and Virk, G. S. 2006. Micropropagation of Coleus blumei from nodal segments and shoot tips. Biologia Plantarum. 50(4): 496-500.

Sayeed Hasan, A. K. M. and Roy, S. K. 2004. Micropropagation of Smilax zeylanica L., a perennial climbing medicinal shrub, through axillary shoot proliferation. Bangladesh J. Life Sci. 16(1): 33-39.

Stuart, M. 1982. The Encyclopedia of Herb and Herbalism. Orbis Publishing, London. p. 203.

Wakhlu, A. K. and Sharma, R. K. 1998. Micropropagation of Heracleum candicans Wall: a rare

medicinal herb. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant., 35: 79-81.

Yen, G. C., Chen, H. Y. and Peng, H. H. 2001. Evaluation of the cytotoxicity, mutagenicity and antimutagenicity of emerging edible plants. Food Chemical Toxicol., 39: 1045-1053.

Khải Mùi
SBC Scientific