Gi-Won Jang (1,∗), Kwang-Soo Kim (1,2) và  Ro-Dong Park (1,3)

1 - Viện Công nghệ và Khoa học nông nghiệp; 2 - Phòng Trồng trọt; 3 - Phòng Hóa chất Nông nghiệp , Đại học quốc gia Chonnam, Gwangju, 500-757, Hàn Quốc (∗yêu cầu tái bản; Fax: +82-62-530-2139; E-mail: jgw77@yahoo.co.kr)

Để thiết lập và tối ưu quy trình vi nhân giống in vitro cây bẫy ruồi Venus (Dionaea muscipula Ellis), cây ăn thịt, các ảnh hưởng của các loại môi trường, nồng độ môi trường MS, pH, và các loại cytokinin và auxin và hình thành chồi được nghiên cứu khi dùng chồi ba tháng tuổi. Nhân chồi chịu ảnh hưởng nhiều nhất trong môi trường 1/3 MS bổ sung 2.3µM kinetin ở pH 5.5. Các điều kiện tốt nhất để tạo rễ là môi trường 1/3 MS bổ sung 0.5µM IBA. Tất cả các chồi cấy chuyền tạo hệ thống rễ rộng sau 5-6 tuần nuôi cấy. Khi cây con đã có rễ được trồng trong các chậu nhựa chứa rêu than bùn:cát tỉ lệ 1:1, mức sống sót của cây con gần như 100%, và cho thấy sự phát triển bình thường. Cấy chuyền mỗi 8 tuần, 100 cây được nhân giống từ một cây trong một  năm.
 

Các từ viết tắt: BA – 6-benzyladenine; 2,4-D– 2,4-dichlorophenoxyacetic acid; IBA – indole-3-butyric acid; NAA –α-naphthaleneacetic acid; B5– Gamborg và cộng sự (1968); LS – Linsmaier và Skoog (1965); MS – Murashige và Skoog (1962)
 

Giới thiệu:
 

Cây bắt ruồi (Dionaea muscipula Ellis), cây ăn thịt lâu năm là chi đơn loài thuộc họ Droseracea. Hầu hết các cây ăn thịt phát triển trên toàn thế giới nhưng cây bắt ruồi Venus trong tự nhiên chỉ phát triển trong vùng giới hạn ở bờ biển phía Đông USA (Slack, 1981). Cây bắt ruồi Venus được dùng trong nhiều năm như nguồn điều chế thuốc chống ung thư và nhiều hợp chất thứ cấp được dùng như thuốc miễn dịch, chống co giật, chống nắng, phá thai và chất ức chế synthetase chitin (Finnie và Staden, 1993; Pakulski và Budzianowski, 1996). Do các đặc tính bẫy côn trùng, có ứng dụng trang trí và tiềm năng cho mục đích dược phẩm, nhu cầu trồng loài cây này luôn gia tăng.
 

Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đóng vai trò quan trọng trong bảo tồn và vi nhân giống giống cây có nguy cơ tuyệt chủng hay trên bờ tuyệt chủng. Một số báo cáo về nhân giống in vitro các cây ăn thịt khác cố gắng để bảo tồn chúng. Crouch và cộng sự (1990) và van Waes (1985) báo cáo nhân giống in vitro của sundew, Drosera rotundifolia L. bằng nuôi cấy lá. Jang và Park (1999) báo cáo phương pháp cho nhân giống quy mô lớn loài Drosera rotundifolia L. thông qua nuôi cấy chồi. Adams và cộng sự (1979a) mô tả ở Cephalotus follicularis (cây nắp ấm Australian) bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh chồi, và Adams và cộng sự (1979b) cũng mô tả phương pháp cho Pinguicula moranensis (Butterwort) thông qua nuôi cấy mô lá.
 

Ở cây bẫy ruồi Venus, Dionaea muscipula Ellis, chỉ một vài báo cáo được công bố. Beebe (1980) và Parliman và cộng sự (1982b) báo cáo phương pháp tạo chồi bất định từ lá. Minocha (1985) cũng mô tả phương pháp nhân giống in vitro từ mẫu lá trưởng thành. Parliman và cộng sự (1982a) mô tả tạo cây con từ mẫu thân rễ và Hutchinson (1984) báo cáo phương pháp tạo cây con bằng nuôi cấy đỉnh chồi. Teng (1999) báo cáo nuôi cấy in vitro sử dụng mẫu cuống hoa. 
 

Trong nghiên cứu này, phương pháp vi nhân giống in vitro hiệu quả và nhanh chóng của cây bắt ruồi Venus, Dionaea muscipula Ellis, được thiết lập thông qua tối ưu hóa môi trường, pH và các loại cytokinin và auxin để nhân chồi và hình thành rễ.

Hạt cây bắt ruồi Venus (Dionaea muscipula Ellis) được mua từ Triffid Park (Australia) và bảo quản ở 4◦C trước khi dùng để khử trùng bề mặt trong dung dịch NaOCl 1.05% và 0.01% Tween-20 (v/v) trong 20 phút và sau đó rửa với nước cất vô trùng 3 lần. Hai mươi lăm hạt được để lên 25mL môi trường 1/3 MS chứa 3% sucrose, 0.2% gelrite ở pH 5.5 trong đĩa petri khử trùng (15×90 mm). Chúng được nảy mầm và phát triển ở 25±1◦C dưới ánh sáng ống đèn huỳnh quang (30µmol/m²s¹) trong chu kỳ chiếu sáng 16/8 h. Mức nảy mầm dựa vào 500 hạt/nghiệm thức với 2 lần lặp lại là 75.5% trong 10-15 ngày trên môi trường 1/3 MS khi hạt được tiền xử lý ở 4◦C trong 30 ngày. Khi xử lý lạnh trong ít nhất 4 tuần, mức nảy mầm rất thấp (khoảng 20%). Các dữ liệu này cho thấy xử lý lạnh là cần thiết cho nảy mầm nhanh chóng. Điều này là trường hợp nảy mầm của hạt sundew (Jang và Park,1999).
 

Các nuôi cấy được thiết lập sử dụng chồi 3 tháng tuổi (dài 1cm) và duy trì trạng thái nhân lên bằng cấy chuyền mỗi 8 tuần. Môi trường cơ bản (50mL) là 1/3 MS chứa µM kinetin, 3% sucrose, 0.2% gelrite ở pH 5.5 trong chai nuôi cấy 500mL. Cho các thí nghiệm riêng lẻ, 20 mẫu/nghiệm thức được dùng và lặp lại 2 lần. Nhân chồi và hình thành rễ được ghi lại sau 8 tuần nuôi cấy.
 

Các thí nghiệm sơ bộ chỉ ra rằng nhân chồi tốt nhất trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) nhưng nhân chồi kém trên môi trường B5 (Gamborg và cộng sự, 1968). Số chồi/mẫu (10.7 lá/mẫu) trên MS cao hơn trên B5 và môi trường LS (Linsmaier và Skoog, 1965) (4.2-6.4 lá/mẫu). Chiều dài lá (cuống lá và bẫy ruồi) (dài 1.95 cm) trên môi trường MS dài hơn môi trường B5 và LS (dài 1.32–1.4 cm). Kết quả này có lẽ vì tỉ lệ NO³ˉ/NH⁴⁺, nhân tố quan trọng tác động lên sự hấp thu nitrogen và điều chỉnh pH trong quá trình nuôi cấy mô thực vật (Fracago và Echeverrigaray, 2001). Crouch và van Staden (1988) tìm thấy rằng môi trường muối cơ bản tốt nhất cho nuôi cấy chi Drosera là môi trường MS.
 

Các ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS lên nhân chồi từ đoạn cắt chồi được kiểm tra với môi trường 1/3, 1/6, 1/9 MS và không bổ sung cytokinin hay auxin. Nhân chồi bị ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng môi trường MS (Bảng 1). Nhân chồi tốt nhất trên môi trường 1/3 MS (19.55 chồi/mẫu) và thấp nhất trên môi trường 1/9 MS. Chiều dài lá dài nhất trên môi trường 1/3 MS (dài 2.85 cm) và ngắn nhất trên môi trường 1/9 MS sau 8 tuần nuôi cấy. Các dữ liệu này không tương đồng với kết quả của Beebe (1980) khi dùng môi trường MS cho nhân chồi từ nuôi cấy lá Dionaea muscipula Ellis. Khác biệt có lẽ đến từ sự khác nhau của các loài và mô nuôi cấy (chồi với lá, và lá trưởng thành với cây con non) được sử dụng.
 

Ảnh hưởng của cytokinin trong vi nhân giống được đánh giá khi dùng môi trường 1/3 MS bổ sung các nồng độ khác nhau kinetin (0–23.3 µM) và benzyladenine (0–22.2 µM). Nhân chồi có hiệu quả môi trường 1/3 MS bổ sung kinetin cao hơn môi trường 1/3 MS bổ sung BA (Bảng 2). Đặc biệt, môi trường bổ sung BA kiềm chế nhân chồi và chiều dài lá ở tất cả các nồng độ kiểm tra. Nồng độ BA cao hơn cho kết quả sự kiềm chế mạnh hơn. Những cuống lá và bẫy biến dạng được quan sát thấy ở môi trường bổ sung BA. Số lá và chiều dài lá cao nhất trong môi trường bổ sung 2.3 µM kinetin. Nhân chồi (33.5 chồi/mẫu) bằng nuôi cấy chồi trên môi trường 1/3 MS chỉ bổ sung kinetin cho hiệu quả cao nhất trong các thí nghiệm so sánh (Hutchinson, 1984; Minocha, 1985; Parliman và cộng sự, 1982a). Parliman và cộng sự (1982a) báo cáo rằng thân rễ đơn cho ra 14 cây con tạo rễ khi nuôi cấy trên môi trường ½ MS chứa 1.9 mg/L NAA và 0.2 mg/L BA. Parliman và cộng sự (1982b) cũng báo cáo rằng 15 chồi bất định và chồi bên phát sinh từ lá khi nuôi cấy trên môi trường chứa 1.9 mg/L NAA và 0.2 mg/L 2,4-D. Môi trường trước đây có sự kết hợp cytokinin và auxin, và sau này là sự kết hợp của hai loại auxin. Ngược lại, bổ sung vào môi trường 1/3MS của các sự kết hợp 4.5 µM 2,4-D và 2.3 µM kinetin hay 2.2 µM BA, và 5.2 µM NAA và 2.3 µM kinetin hay 2.2 µM BA cho kết quả nhân chồi ít và mẫu hóa nâu trong nghiên cứu này. Sự khác nhau trong nhân chồi cũng đến từ sự khác nhau của mô nuôi cấy như thân rễ, đỉnh chồi, lá và chồi, thêm vào đó sự kết hợp của auxin và cytokinin. Beebe (1980) báo cáo rằng sự hình thành mô sẹo tăng trưởng chậm trong gieo hạt của Dionaea đã đạt được nhưng trong nghiên cứu hiện tại có thử nghiệm để cảm ứng mô sẹo từ lá cho kết quả mẫu hóa nâu nhanh hơn. Các nghiên cứu trước của Minocha (1985), Parliman và cộng sự (1982a), và Hutchinson (1984) đề cập đến việc ít hình thành mô sẹo ở mẫu lá và thân rễ Dionaea.
 

pH được biết đến trong các ảnh hưởng đến sự hấp thụ môi trường và nhân chồi (Parliman và cộng sự, 1982a), ảnh hưởng của pH môi trường (3.5, 4.5, 5.5 và 6.5) được kiểm tra trên môi trường 1/3 MS bổ sung 2.3 µM kinetin. pH tối ưu cho việc nhân chồi và kéo dài chồi là pH 5.5 và nó cũng ức chế nghiêm trọng trong môi trường có tính acid. Rễ phát triển tốt ở pH 5.5 và 6.5 nhưng không phát triển ở các pH thấp hơn. Các dữ liệu này tương đương với các dữ liệu trước của Hutchinson (1984) rằng số chồi cao nhất trên môi trường ở pH 5.5. Parliman và cộng sự (1982a) nuôi cấy thân rễ mẫu Dionaea muscipula Ellis trên môi trường pH 4.9.
 

Để kiểm tra ảnh hưởng của auxin lên sự tạo rễ, đoạn cắt 2-3 cm từ các nuôi cấy phát triển với 2.3µM kinetin được chuyển qua môi trường 1/3 MS bổ sung 3 loại auxin (IBA, 2,4-D hay NAA) ở các nồng độ khác nhau (IBA, 0–24.6; 2,4-D; 0.5–22.6; NAA, 0.5–26.1 µM). Sự hình thành rễ hiệu quả nhất trong môi trường bổ sung IBA và tốt nhất trên môi trường 1/3 MS bổ sung 0.5 µM IBA (Bảng 3). Tuy nhiên, sự bổ sung 2,4-D hoặc NAA mạnh ức chế sự hình thành rễ. Các dữ liệu này cũng tương đồng với Hutchinson (1984) khi bổ sung NAA trong vi nhân giống Dionaea muscipula Ellis in vitro cũng ức chế hoàn toàn sự hình thành rễ. Không có auxin, mức hình thành rễ trong nghiên cứu này là 70.8%, khi so với các kết quả của Janssens (1986) và van Waes (1985) cho thấy ít cần hormone trong cảm ứng rễ ở Drocera regia Stephens.
 

Sau khi cấy chuyền trong 1/3 MS bổ sung 2.3 µM kinetin trong 8 tuần, chồi non được phát triển đủ để tách ra thành các cây riêng lẻ. Các chồi được tách ra được tạo bộ rễ trong môi trường 1/3 MS chứa 0.5 µM IBA sau 6-8 tuần nuôi cấy. Rễ màu đen, không chẻ nhánh và được bao phủ hoàn toàn bằng rễ tơ. Cây bắt ruồi Venus nhìn chung có bộ rễ yếu trong tự nhiên (Juniper và cộng sự, 1989).
 

Cây con có rễ được rửa sạch dưới vòi nước chảy và chuyển qua chậu nhựa chứa hỗn hợp rêu than bùn và cát (1:1). Các chậu được bọc tạm thời với hộp nhựa có nắp mở để đảm bảo ẩm độ cao và mở từ từ trong giai đoạn thuần dưỡng 2 tuần. Tủ tăng trưởng duy trì 20–25◦C với cường độ ánh sáng 60 µmol/m²s¹ (ánh sáng đèn huỳnh quang với đèn halogen kim loại) với chu kỳ sáng 16/8h từ tháng 3 tới tháng 9. Cây được bón phân với dung dịch 0.1% Hyponex sau khi chuyển ra chậu. Cây được thuần dưỡng sau đó được chuyển ra nhà kính. Tỉ lệ sống sót là 100% và các cây con phát triển tốt. Hệ thống rễ in vitro tiếp tục phát triển, cho thấy khả năng sống sót và chức năng bình thường của chúng. Điều này trái ngược với nhiều cây thường hình thành hệ thống rễ mới sau khi chuyển ra đất, vì môi trường phức hợp không ổn định và không đáp ứng đủ chức năng. Trong 1 tuần sau khi chuyển ra, lá thực hiện chức năng bình thường và có thể bắt côn trùng. Thông qua quy trình nuôi cấy chồi in vitro của cây bắt ruồi Venus, Dionaea muscipula Ellis được mô tả, hàng trăm cây quý giá có thể nhân lên trong vòng 1 năm chỉ với một chồi ban đầu, cho thấy tính khả thi của nhân giống in vitro quy mô lớn  cũa cây bẫy ruồi Venus. 

 

 

Adams RM, Koenigsberg SS & Langhans RW (1979a) In vitro propagation of Cephalotus follicularis(Australian pitcher plant).HortScience. 14: 512–513

Adams RM, Koenigsberg SS & Langhans RW (1979b) In vitro propagation of the butterwort Pinguicula moranensis H.B.K.HortScience. 14: 701–702

Beebe JD (1980) Morphogenetic responses of seedlings and adventitious buds of the carnivorous plant Dionea muscipulain aseptic culture. Bot. Gaz. 141: 396–400

Crouch IJ & van Staden J (1988) In vitro propagation of Drosera natalensis. S. Afr. J. Bot. 54: 94–95

Crouch IJ, Finnie JF & van Staden J (1990) Studies on the isolation of plumbagin fromin vitro andin vivo grown Drosera species.Plant Cell Tiss. Org. Cult. 21: 79–82

Finnie JF & van Staden J (1993) XII Droseraspp (sundew): Micropropagation and in vitro production of plumbagin. In: Bajaj YPS (ed) Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 24 (pp164–177). Springer, Berlin

Fracago F & Echeverrigaray S (2001) Micropropagation of Cunila galioides, a popular medicinal plant of south Brazil. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 64: 1–4

Gamborg OL, Miller RA & Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell. Res. 50: 151–158

Hutchinson JF (1984) In vitro propagation of Dionaea muscipula Ellis (Venus Fly Trap). Sci. Hortic. 22: 189–194

Jang GW & Park RD (1999) Mass propagation of sundew,Drosera rotundifolia L. through Shoot Culture. J. Plant Biotechnol. 2: 97–100

Janssens J (1986) In vitro propagation of sundew Drosera regia Stephens. Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. Gent. 51: 61–66

Juniper BE, Robins RJ & Joel DM (1989) The Carnivorous Plants.Academic Press, London

Linsmaier EM & Skoog F (1965) Organic growth factor requirements of tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 18: 100–127

Minocha SC (1985)In Vitro propagation of Dionaea muscipula.Hort Science. 20: 216–217

Murashige T & Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1:474–497

Pakulski G & Budzianowski J (1996) Ellagic acid derivatives and naphthoquinones of Dionaea muscipulafrom in vitro cultures. Phytochemistry 41: 775–778

Parliman BJ, Evans PT & Rupert EA (1982a) Tissue culture of single rhizome explant of Dionaea muscipula Ellis ex. L., the Venus Fly-trap, for rapid asexual propagation. J. Am. Soc.Hortic. Sci. 107: 305–310

Parliman BJ, Evans PT & Mazur AR (1982b) Adventitious bud differentiation and development in leaf culture of Dionaea muscipulaEllis ex. L. (Venus Fly-trap) culturedin vitro.J.Am.Soc.Hortic. Sci. 107: 310–316

Slack A (1981) Carnivorous Plants. MIT Press, Cambridge, MA Teng WL (1999) Source, etiolation and orientation of explants affect in vitro regeneration of Venus fly-trap (Dionaea muscipula).Plant Cell Rep. 18: 363–368

van Waes J (1985) Vermenigvuldiging van zonnedauw (Drosera) in proefbuizen. Verbondsnieuws 29: 547–551

Trâm Anh
SBC Scientific