Nghiên cứu này cho thấy có thể nhân giống Helleborus niger bằng phương pháp tạo dòng in vitro. Môi trường Universal (U) được dùng cho nuôi cấy in vitro. Môi trường này được tạo bởi Haensch như là môi trường phổ biến  để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng mức trung bình của nhiều loài thực vật. Các chồi đỉnh của cây Helleborus niger gieo hạt được thiết lập trên môi trường U bổ sung 8.9 µmol/l 6-benzylaminopurine (BAP) và 2.7 µmol/l α-naphthaleneacetic acid. Nhân giống được tiến hành trên môi trường U bổ sung 2.2 µmol/l BAP và 2.9 µmol/l gibberellic acid. Mức tạo rễ thành công cao nhất là 96.7% đạt được khi bổ sung 4.9 µmol/l indole-3-butyric acid vào môi trường. Tạo chồi và tạo rễ phụ thuộc vào dòng gieo hạt. Hơn 80% cây in vitro sống và phát triển mạnh trong nhà kính. 

 

Từ viết tắt: BAP: 6-Benzylaminopurine · IBA: Indole-3-butyric acid · NAA: α-Naphthaleneacetic acid · GA₃: Gibberellic acid · U-medium: Universal medium
 

Chi Helleborus bao gồm 20 loài, nhưng hầu hết các nhà làm vườn tập trung vào Helleborus niger (Rupprecht và Miessner 1985). Chi này trở nên quan trọng hơn bao giờ hết trong thương mại, như vườn cây hoa lâu năm trong mùa đông và đầu xuân hoặc như hoa cắt cành. Bằng cách chọn lọc cẩn thận và canh tác, các nhà làm vườn có thể nới rộng vùng màu hoa và các hình dáng khác của lá và hoa khi nở. Các vấn đề với cây thường tập trung vào nhân giống chúng, xảy ra cả trong nhân giống sinh dưỡng và thông qua gieo hạt (Hay và Synge 1976; Jelitto và cộng sự 1985; Rupprecht và Miessner 1985; Ahlburg 1989; Schmiemann 1996). Các phương pháp nhân giống nhìn chung hướng đến tạo các cây với mức biến dị cao trong giai đoạn ra hoa và cả kích thước với màu sắc khi nở hoa. Các phương pháp nhân giống sinh dưỡng thông qua phân chia thân rễ tốn nhiều thời gian và không thể đảm bảo mức thành công cao. Theo Rupprecht và Miessner (1985), tạo dòng có thể tạo khoảng 1000 cây từ một cá thể cho duy nhất trong khoảng thời gian 10-12 năm. Nếu phương pháp nuôi cấy mô cho các mục tiêu nhân giống có thể được phát triển, mức nhân giống thành công có thể tăng đáng kể. Điều này lần lượt có thể rút ngắn chu kỳ trồng và cho phép nhà làm vườn giới thiệu nhiều giống mới hơn. Vật liệu dy truyền dự tính cho nhân giống có thể được nhân lên một cách đơn giản, và nhà làm vườn sẽ có thể điều khiển toàn bộ tất cả các tiến trình; ví dụ, anh ấy/cô ấy có thể tạo các cây con mà thật sự không phụ thuộc vào thời vụ trong năm. Tuy nhiên, nuôi cấy in vitro của Helleborus vẫn còn nhiều khó khăn. Springer (1995) báo cáo sự cố gắng thành công trong nhân giống in vitro, đưa ra chi tiết thông tin về cả các loài Helleborus được nhân giống hay phương pháp nuôi cấy được dùng. Lim và Kitto (1995) cho thấy hệ thống dùng cho H. orientalis Lam trong nhân giống chồi được tiến hành in vitro và tạo rễ được thực hiện ex vitro.
 

Mục tiêu của nghiên cứu báo cáo ở đây được thiết lập hệ thống nhân giống in vitro để khám phá H. niger, cụ thể, khả năng cảm ứng tái sinh rễ ở chồi in vitro. Những tập trung được nghiên cứu phân tích so sánh tác động của các nồng độ IBA và NAA khác nhau lên quá trình hình thành rễ (ví dụ sự sinh sản) và tăng trưởng. Các ảnh hưởng của GA₃ trong môi trường tạo rễ được kiểm tra. Morzadec và Hourmant (1997) cũng cho thấy những ảnh hưởng tích cực của GA₃ khi kết hợp với NAA lên sự sinh sản in vitro của rễ ở Cynara scolymus L.
 

Thoạt nhìn, các chồi thân rễ có thể thấy là sự lựa chọn tự nhiên như vật liệu thô cho tiến trình nhân giống tạo dòng in vitro. Tuy nhiên, việc này chứa đựng nguy cơ nhiễm cao khi thực hiện với các phần ở dưới đất. Nếu tỉ lệ thất thoát cao do các mẫu bị nhiễm gây khó khăn ảnh hưởng chung trong nghiên cứu các chồi thích hợp, nó gần như không thể tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy có nghĩa. Trong nỗ lực để giải quyết các vấn đề này trong thời gian tới, nghiên cứu này dựa vào việc dùng cây gieo hạt phát triển in vitro và ex vitro.

Các thí nghiệm được thực hiện với Helleborus niger (hoa hồng Giáng sinh trắng). Các hạt được cung cấp bởi Jelitto Staudensamen, Schwarmstedt, Germany.
 

Các hạt được tiền khử trùng trong 30 giây với dung dịch alcohol 70% và sau đó ngâm trong nước khử trùng trong 20 giờ. Chúng sau đó được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cách ngâm và khuấy liên tục trong dung dịch natri hypochloride (12% chorine hoạt tính) trong 20 phút, tiếp theo rửa 3 lần với nước cất vô trùng Tween 20 được thêm vào trong dung dịch khử trùng để hạn chế sức căng bề mặt. Các hạt được thiết lập cả trong dung dịch nguyên tố vết (trong dạng cải tiến) phù hợp với Heller (1953) và trên môi trường U (Haensch 1999). Thí nghiệm được tiến hành trong phòng điều kiện tối duy trì ở các nhiệt độ khác nhau. Các nhiệt độ trong nuôi cấy in vitro được để phù hợp với hướng dẫn nảy mầm in vivo ban hành bởi Jelitto và cộng sự (l985): 6 tuần ở 20-22°C, sau đó 6 tuần ở 4°C và nuôi cấy ở điểm nảy mầm ở 10°C.
 

Để thiết lập ảnh hưởng của phương pháp khử trùng, các hạt được trồng trên mặt đất như nhóm đối chứng/tham khảo về các hạt nuôi cấy in vitro. Trên mỗi nhóm, 180 hạt được khử trùng/không khử trùng như mô tả và trồng trong hộp nhựa (200x140x30 cm) với 2/3 là đất. Các điều kiện nuôi cấy giống nhau với những mô tả trên cho sự khử trùng hạt nảy mầm.
 

Cơ chất đất được phối trộn của than bùn vùng cao unfertilised (nguyên văn: unfertilised highland peat), perlite và cát (1:1:1) được hấp khử trùng ở 121°C trong 45 phút. Mỗi vật chứa để trồng, 3x30 hạt được trồng.
 

Cây gieo hạt một năm tuổi phát triển dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau được dùng như vật liệu thô cho các thí nghiệm tạo dòng in vitro. Các chồi đỉnh được dùng như mẫu thí nghiệm. Các chồi đỉnh của cây gieo hạt được nảy mầm trong cơ chất đất được khử trùng bằng cách đầu tiên ngâm 30 giây với dung dịch cồn 70%, sau đó 3 phút với dung dịch bạc nitrat 0.8%. Chúng được rửa 3 lần trong nước cất vô trùng.
 

Vật liệu cây trồng và các lần cấy chuyền sau đó được thiết lập trên môi trường U bổ sung 8.9 µmol/l BAP và 2.7 µmol/l NAA. Sau 17 lần cấy chuyền, nuôi cấy được liên tục trên môi trường không có NAA, với nồng độ BAP giảm xuống 2.2 µmol/l và bổ sung 2.9 µmol/l của GA₃.
 

Hai lần cấy chuyền đầu tiên được tiến hành trong khoảng thời gian 4 tuần, sau đó chúng được thực hiện trong các khoảng thời gian 3 tháng. Nuôi cấy được để trong nhiệt độ 23°C đầu tiên trong điều kiện phòng. Từ lần cấy chuyền thứ ba trở đi, nhiệt độ được giảm xuống 15°C. Trong các giai đoạn nhân giống và tạo rễ tiếp theo, nhịp độ ngày/đêm được thiết lập ở 16/8 giờ, và nhiệt độ duy trì ở 16°C.
 

Mục tiêu tạo rễ, các auxin IBA và NAA được đánh giá và bổ sung vào môi trường U (trong các nồng độ 0, 4.9, 14.7 và 29.4 µmol/l). Thêm vào đó, các ảnh hưởng của 4.9 µmol/l IBA hay 4.9 µmol/l NAA khi kết hợp với 2.9 µmol/l và 14.4 µmol/l GA₃ cũng được nghiên cứu. Hai mươi chồi của 3 kiểu gen được hình thành trên mỗi giống.
 

Phương pháp tạo rễ cải tiến phù hợp với Bouza và cộng sự (1994) được kiểm tra trên 3 kiểu gen bổ sung. Hai mươi chồi trên mỗi kiểu gen được chuyển sang môi trường cảm ứng tạo rễ (chứa 75 µmol/l IBA và 4% saccharose) trong giai đoạn 10 ngày cảm ứng và để trong tối. Các giai đoạn nuôi cấy tiếp theo được tiến hành trên môi trường phát triển rễ không bổ sung hormon với hàm lượng 0.3% than hoạt tính và nồng độ sacchrose 3%. Nuôi cấy được để trong điều kiện phòng duy trì nhịp độ ngày/đêm là 16/8 giờ và nhiệt độ ở 16°C. Các bonitures (Bonitur là đánh giá chuyên nghiệp, định tính đối với các đối tượng nông nghiệp. Hoạt động được gọi là "bonitieren". Ban đầu, bonitur là, tương tự như kiểm kê, một đánh giá chuyên gia về chất lượng, chẳng hạn như len và vải len. Thuật ngữ này chỉ được sử dụng trong bối cảnh nông nghiệp, ví dụ, để thu thập các đặc tính của thực vật hoặc đất nông nghiệp.) cho mục tiêu tạo rễ được tiến hành sau 8 tuần.
 

Các cây con tạo rễ được đặt trong các khay phát triển và chuyển sang nhà kính. Trong 2 tuần đầu chúng được nuôi cấy dưới giấy bạc bao phủ giữ mức ẩm độ 100%. Sau đó, các cây được thuần hóa cẩn thận trong điều kiện khí quyển để cho chúng cơ hội thích nghi từ từ với điều kiện bình thường của nhà kính. Cơ chất được phối trộn của của than bùn vùng cao unfertilised, đất, perlite và cát (2:2:1:1).
 

Sự so sánh giữa mức tạo rễ cá thể được tiến hành trên cơ sở phép thử χ², khi phép thử Mann-Whitney được dùng để phân tích dữ liệu được thu thập về số rễ và chiều dài rễ trong vấn đề. Các chồi vô trùng sống sót thiết lập cơ bản  của phân tích thống kê. Các kết quả thống kê cho biết ảnh hưởng của nồng độ auxin được dựa trên sai số kiểm tra liên quan mức xác suất αᵥ<0.01 và sai số so sánh liên quan mức xác suất cả α=0.002 (Bảng 2) hay α=0.005 (Bảng 3).
 

Các hạt được xử lý với NaOCl có mức nhiễm 16.7% (của 281 hạt khảo sát). Sau thời gian 7 tháng nuôi cấy, mức nảy mầm cực kỳ chậm, 23.4% của các hạt không nhiễm nảy mầm trên dung dịch có thành phần vi lượng cải tiến trái ngược với 14.8% của 81 hạt không nhiễm trên môi trường U.
 

Sự phát triển của cây gieo hạt in vivo
 

Các hạt bắt đầu nảy mầm sau 6 tháng trồng. Tỉ lệ hạt nảy mầm trong khoảng trung bình trong nhóm được tiền khử trùng. Các hạt khử trùng NaOCl có mức nảy mầm 33.3%, cao hơn 4.4% so với các hạt không khử trùng. Nảy mầm in vivo cao hơn đáng kể so với nảy mầm in vitro.

Hình 1A-C Nuôi cấy in vitro Helleborus niger (hoa hồng giáng sinh trắng). A Pha vi nhân giống; Nhân chồi sau 3 tháng nuôi cấy trên môi trường U bổ sung 2.2 µmol/L BAP và 2.9 µmol/l GA₃. B Cây in vitro tạo rễ sau 8 tuần trên môi trường U bổ sung 4.9 µmol/l IBA. C Thuần dưỡng cây in vitro sau 6 tháng trồng trong nhà kính
 

Bảng 1 Phản ứng của mẫu đỉnh chồi của H. niger trong vi nhân giống
 

Giai đoạn pha của mẫu	Thời gian (tháng)	Số
Các mẫu sơ bộ (chồi đỉnh)	0	130
Các mẫu khả thi	1	64
Nhân mẫu, tối đa 3 chồi trên một mẫu	11	43
Nhân mẫu, tối đa 10 chồi trên một mẫu	26	2,026ᵃ

ᵃ Từ 26 dòng cây gieo hạt

Bảng 2 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ của chồi in vitro của H. niger (thời gian nuôi cấy 8 tuần)

Nồng độ auxin (mg/L)	Tần số tạo rễ ᵃ (%)		Số rễ/chồi ᵃ		Chiều dài rễ ᵃ (cm)
	IBA	NAA	IBA	NAA	IBA	NAA
0	60.0a	60.0a	1.7a	1.7a	0.9ab	0.9a
4.9	96.4b	68.3a	3.1b	2.6ab	1.1ab	0.8a
14.7	90.7b	83.3a	4.5b	4.4b	1.2a	0.5ab
29.8	81.7ab	75.0a	3.4b	4.4b	0.7b	0.4b

 

Trong 130 mẫu được thiết lập, 64 (49.2%) sống sau 4 tuần đầu (Bảng 1). Mức sống sót (73.4%) của các cây gieo hạt phát triển trong các điều kiện vô trùng cao hơn đáng kể so với các mẫu cây gieo hạt phát triển trên nền đất (25.8%). Mức thất bại cao sau này vì nhiễm nấm và vi khuẩn. Sự tăng trưởng của các mẫu thiết lập vẫn có tốc độ rất chậm. Nhiều chồi xốp của các búp đầu tiên được quan sát thấy sau 4 tháng. Việc này tốn 7 tháng trước khi nhân chồi được khởi đầu và sự phân chia đầu tiên xảy ra. Vào cuối giai đoạn 11 tháng, các mẫu phát triển đầy đủ cho nhân giống sau này (Hình 1A). Mức giảm sút trung bình giữa các bước nhân giống riêng lẻ đạt mức khoảng 5%.
 

Mức nhân giống của các cây gieo hạt riêng lẻ thay đổi khá rộng. Trong 26 tháng nghiên cứu, các cây gieo hạt phát triển trong khoảng 6 đến 280 cụm chồi. Cuối giai đoạn 26 tháng, 26 dòng cây gieo hạt được cho 2,026 cụm chồi với 10 búp chồi và các chồi được phát triển. Dựa vào điều này, một có thể tính trung bình mức nhân giống của 78 cụm chồi cho mỗi cây gieo hạt. Các chồi phát triển tốt được tách ra để tiến hành tạo rễ.

Tác động của IBA và NAA
 

Bốn tuần sau khi các chồi được chuyển qua môi trường có auxin, các chồi hình thành rễ đầu tiên có thể được quan sát thấy (Hình 1B). Môi trường bổ sung IBA và NAA cho thấy sự khác biệt quan trọng trong đặc điểm tạo rễ (Bảng 2). Khi cả khi nồng độ là 14.7 µmol/l, 31.5% các chồi nuôi cấy với môi trường có IBA và chỉ 6.7% chồi nuôi cấy với môi trường chứa NAA có rễ sau 4 tuần; điều này tương phản với mức 5% chồi tạo rễ trên môi trường không auxin. Mức tạo rễ cao nhất được ghi nhận sau giai đoạn 8 tuần khi mức tạo rễ trung bình của chồi phát triển trên môi trường chứa IBA (trừ nồng độ 29.4 µmol/l) vượt quá 90%, trong khi  đó mức tạo rễ trung bình của chồi phát triển trên môi trường chứa NAA giảm dưới 90%. Ngay cả khi trên môi trường không có auxin, 60% chồi cho thấy dấu hiệu phát triển rễ. IBA ở các nồng độ 4.9 µmol/l và 14.7 µmol/l có khả năng cải thiện quan trọng lên sự phát triển rễ khi so sánh với các kết quả quan sát trên môi trường không có auxin. Khi nồng độ IBA tăng từ 4.9 lên 29.4 µmol/l, số chồi hình thành rễ hơi giảm. Trung bình, khoảng 1.7-4.5 rễ phát triển trên một chồi. Tất cả các nồng độ IBA dùng trong thí nghiệm tăng số rễ trung bình lên đáng kể khi so với sự phát triển rễ trên môi trường không có auxin. Về NAA cũng cho ảnh hưởng tương tự, tuy nhiên, nồng độ được tăng đến 14.7 µmol/l.
 

Bảng 3 Ảnh hưởng của GA₃ lên sự hình thành rễ của chồi in vitro H. niger (thời gian nuôi cấy 8 tuần)

Nồng độ  (µmol/l)		Tần số tạo rễ ᵃ (%)		Số rễ/chồi ᵃ		Chiều dài rễ ᵃ (cm)
Auxin	GA₃	IBA	NAA	IBA	NAA	IBA	NAA
4.9	0	96.4a	68.3 a	3.1 a	2.6 a	1.1 a	0.8 a
4.9	2.9	90.0ab	66.7 a	3.2 a	2.5 a	1.7b	0.8 a
4.9	14.4	71.9b	73.3 a	2.8 a	2.4 a	1.6 ab	0.9 a

ᵃCác giá trị theo sau bằng các chữ cái giống nhau không có khác biệt có nghĩa ở P<0.01

Chiều dài trung bình của rễ trong khoảng 1.2-0.4 cm (Bảng 2). Liên hệ với chiều dài, IBA có biểu hiện tích cực, khi NAA có biểu hiện tiêu cực hơn. Các nồng độ cao của cả hai loại auxin (29.8 µmol/l) cho kết quả rễ ngắn hơn. Việc giảm chiều dài, tuy nhiên, chỉ có nghĩa cho NAA khi liên hệ với môi trường không auxin. Các rễ phát triển trên môi trường không có NAA có chất lượng thấp hơn các rễ từ chồi phát triển trên môi trường IBA, chúng hóa nâu và thấp, thường có các đặc điểm bất thường.

Khi tiếp xúc với mức IBA cao (75 µmol/l) trên môi trường trong 10 ngày sau đó nuôi cấy trên môi trường không có hormon, chỉ 60% chồi tạo rễ cho một kiểu gen và 80% cho các kiểu gen còn lại. Mỗi chồi phát triển trung bình 4.6 rễ với chiều dài có nghĩa là 0.9cm.
 

Sự bổ sung GA₃ vào môi trường tạo rễ có IBA không có hiệu quả kích thích len sự tạo rễ của chồi in vitro (Bảng 3). Ngược lại, tỉ lệ của chồi tạo rễ thấp. Khi 14.4 µmol/l của GA₃ được thêm vào môi trường, mức tạo rễ giảm đáng kể (đến 24%) từ 71.9%. GA₃ không cho thấy tác động lên số rễ phát triển, mặc dù chồi tiếp xúc với nồng độ GA₃ cao nhất thì vần phát triển khá ít rễ (trung bình 2.8). Tuy nhiên, sự bổ sung GA₃ vào môi trường có IBA cho ảnh hưởng tích cực lên chiều dài rễ. Sự bổ sung GA₃ vào môi trường có NAA không cho thấy sự ảnh hưởng lên sự phát triển rễ.

Thiết lập mức cây in vitro ngoài nhà kính
 

Ba tháng sau khi cây chuyển qua ex vitro, các mức hình thành khác biệt lớn. Chỉ 75.2% cây tạo rễ trên NAA sống sót, trong khi đó 88.1% cây tạo rễ trên IBA hình thành đầy đủ. Cây tạo rễ trên môi trường không auxin phát triển mức hình thành rễ là 86.1%. Hình 1C cho thấy cây in vitro đáp ứng tốt với môi trường xung quanh.
 

Các kết quả cho thấy rõ ràng có thể nhân giống Helleborus niger bằng nuôi cấy in vitro. Thách thức lớn nhất là thiết lập các mẫu không nhiễm. Thoạt nhìn, quy trình để dựng lên sự cung cấp cây nhân giống in vitro có thể thấy khá dài – 11 tháng. Thứ nhất, tuy rằng số mẫu nhân giống đầy đủ tại chỗ, số lớn cành có thể có sẵn sau thời gian ngắn. Cơ sở của nhân giống dựa vào 78 cụm chồi sau 2 tháng, mức phân chia của 2.1 cụm chồi trong bước nhân giống 3 tháng (dựa vào các kết quả hiện tại) và mức giảm 5%, thêm 3 năm sẽ đủ để tạo hơn 300.000 cụm chồi trên một cây ban đầu. Điều này có thể cho phép người làm vườn nhân giống và số lượng thị trường lớn của cây lai với đặc tính cụ thể và các đặc điểm – như ví dụ là tính chịu lạnh – vốn không thể nhân giống thông thường, hay nhân giống sinh dưỡng của chúng cũng phức tạp hóa và tốn kém (Schmiemann 1996).
 

Trong quá trình nghiên cứu nó trở nên rõ ràng các mẫu chỉ có thể chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới liên hệ với khoảng thời gian dài, ví dụ khoảng  lần 3 tháng. Tương đồng với các phương pháp nhân giống thông thường là hiển nhiên. Các tác giả được mô tả sự nuôi cấy ngoài trời như sau: “H. niger có xu hướng chống lại sự phân chia” (Schmiemann 1996); “cô ấy không thích bị làm phiền” (McLewin và cộng sự 1995); “bạn nên cho cô ấy thời gian để ổn định” (Fessler 1980; Ahlburg 1989). Điều này cũng giải thích tại sao sự tăng trưởng in vitro của các mẫu tiếp tục ở tốc độ chậm: rõ ràng thời gian thích nghi các điều kiện nuôi cấy in vitro là cần thiết. Sự tạo rễ của các chồi in vitro không dẫn đến bất kỳ vấn đề lớn nào. Các chồi phát triển tốt có thể được tách ra cho mục đích tạo rễ khi cần thiết.

Nhân giống trên môi trường chứa auxin nhìn chung cho kết quả tỷ lệ chồi tạo rễ lớn hơn và số rễ cao hơn so với nuôi cấy trên môi trường không có auxin (Bảng 2). Các kết quả có thể giải thích bằng tác động thúc đẩy của các auxin lên sự hình thành rễ, như hiện tại quan sát bởi De Klerk và cộng sự (1999). Như các kết quả từ nghiên cứu hiện tại biểu thị, IBA và NAA mặc dù cho các kết quả tạo rễ tương đương, có xu hướng ức chế sự tăng trưởng rễ ở các nồng độ cao. Các nồng độ auxin kích thích tái sinh rễ có thể ảnh hưởng tiêu cực lên sự phát triển và tăng trưởng của các rễ này (De Klerk và cộng sự 1999). Điều này được giải thích bằng nhu cầu hormon khác nhau trong giai đoạn cảm ứng và tăng trưởng rễ (De Klerk và cộng sự 1999). Trong các giai đoạn sự phát triển rễ và tăng trưởng sau này của cây, IBA được khám phá tạo ra các kết quả tốt hơn NAA. Điều này được xác nhận các thí nghiệm kích thích với Paeonia officinalis (Seyring, các kết quả chưa công bố). Mức tạo rễ thấp hơn phát triển trên môi trường NAA và tác động tiêu cực của NAA lên chất lượng rễ có thể liên hệ với các kết quả của nghiên cứu của Eucalyptus tereticornis (Sharma và Ramamurthy 2000). Các mức khác nhau của hiệu quả của các auxin khác nhau có thể giải thích trong các giai đoạn sinh lý ảnh hưởng và các thành phần ổn định. IBA và NAA có cả các auxin ổn định khi so sánh với IBA. Các nồng độ thúc đẩy tối đa cảm ứng rễ, tuy nhiên, có xu hướng ức chế sự tăng trưởng sau này lên các rễ. Trái ngược với NAA, IBA có thể không hoạt động đến một điểm bằng sự oxi hóa (De Klerk và cộng sự 1999).  Điều này có thể giúp giảm ảnh hưởng của nồng độ có thể gây hại.
 

Các nghiên cứu trên Paeonia suffruticosa Andr. (Bouza và cộng sự 1992) và Malus (De Klerk và cộng sự 1999) cho thấy sụ cảm ứng tạo rễ xảy ra trong 10 ngày đầu. Tiếp theo giai đoạn này, auxin không cần nữa và vì vậy chỉ có ảnh hưởng bất lợi. Dựa vào các thí nghiện của chúng tôi với H. niger, chúng tôi thấy tự tin khi dự đoán nuôi cấy trong thời gian ngắn các chồi trên môi trường có nồng độ auxin cao sẽ cho kết quả phát triển rễ khỏe mạnh (Bouza và cộng sự 1994; De Klerk và cộng sự 1999; Seyring 2000). Nhược điểm của phương pháp này là các chồi phải được chuyển lại môi trường không bổ sung hormone một lần nữa.
 

Ngược lại các kết quả đạt được bởi Seyring (2000) với Paeonia officinalis, trong sự cải tiến tăng nồng độ IBA không tạo ra sự gia tăng tương ứng của số chồi tạo rễ ở H. niger. Ngược lại thì số chồi tạo rễ của H. niger giảm xuống. Điều này biểu hiện nhu cầu auxin khác nhau của các loài khác nhau. Hơn nữa, H. niger phát triển rễ trên 60% của các chồi trong môi trường không có auxin; thông số tương ứng của Paeonia tenuifolia (Seyring 2000) tối đa là 20%. Điều này có thể vì thành phần phytohormon nội sinh trong chồi (De Klerk và cộng sự 1999). Khả năng tạo rễ tăng có liên quan đến mức IAA nội sinh cao hơn và mức BA thấp hơn ở Paeonia suffruticosa Andr. (Bouza và cộng sự 1994).
 

Sự có mặt của GA₃ trong môi trường cũng không làm tăng hay giảm mức tạo rễ. Các kết quả đạt được khi tạo rễ Cynara scolymus L. trên môi trường chứa NAA và GA₃ (Morzadec và Hourmant 1997) có thể vì vậy không lặp lại ở H. niger. Tuy nhiên, Morzadec và Hourmant (1997) chỉ dùng nồng độ NAA là 2.68 µmol/l trong nghiên cứu của họ, trong khi 4.9 µmol/l NAA kết hợp với GA₃ được dùng để kích thích sự phát triển rễ ở H. niger. Có thể sự kết hợp được chọn của auxin và gibberellic trong nghiên cứu này không thích hợp. Koblitz (1972) mô tả cái ông ấy gọi là hiệu quả kích thích của gibberellic nếu kết hợp phù hợp với auxin nhưng thất bại để chỉ rõ sự ảnh hướng rất tự nhiên. Các nghiên cứu sinh lý của các cành con cây nho đỏ đã chứng minh các ảnh hưởng của gibberellic lên sự hình thành rễ (Brauner và Bukatsch 1980). Tuy nhiên, vai trò chính xác mà gibberellic đóng trong quy trình này vẫn cần được xác minh.

Các kiểu gen dưới sự quan sát cho thấy mức khác nhau liên quan đến khả năng của chúng trong nhân chồi và phát triển rễ. Điều này cho thấy phù hợp với các phát hiện trong các nghiên cứu khác: Seyring (1996) với Ptilotus exaltatus và Pierik và cộng sự (1997) với Quercus robur. Sử dụng phương pháp được mô tả ở đây cho H. niger cần được cân nhắc khi biến đổi gen có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy.
 

Các nghiên cứu tiếp theo cần được thiết lập phạm vi mà hệ thống nhân giống H. orientalis Lam. Phát triển bởi Lim và Kitto (1995) thích hợp cho H. niger. Ưu điểm của hệ thống này là sự tạo rễ có thể tiến hành ex vitro.

Các kết quả biểu thị ở đây cho thấy nhân giống in vitro H. niger để cung cấp lợi nhuận lớn, cung ứng cây dựa vào nhân giống diễn ra trong phạm vi lớn của biến dị và các cây gieo hạt cho phép thời gian đủ để thích nghi với điều kiện nuôi cấy in vitro. Ở bất kỳ mức nào, kỹ thuật trình bày trong bài báo này cho thấy cần tối ưu hơn nữa trước khi ứng dụng thực tiễn có tính khả thi để có thể được phát triển.
 

Lời cảm ơn: Tác giả bài tổng quan này được hỗ trợ bởi Bộ Dinh dưỡng, Nông lâm nghiệp của Cộng hòa Liên bang Đức, Bộ Dinh dưỡng, Nông lâm nghiệp Tiểu bang Brandenburg và Bộ Dinh dưỡng, Nông lâm nghiệp của Tiểu bang tự do Thuringia. Tác giả cảm ơn Bà Katja Krüger cho các hỗ trợ kỹ thuật của bà.

Ahlburg MS (1989) Helleborus. Ulmer, Stuttgart

Bouza L, Scotta B, Bonnet M, Jaques M, Arnaud Y (1992) Hormone content and meristematic activity of Paeonia suffruticosa Andr. cv. Madame de Vatry vitro plants during in vitro rooting. Acta Hortic 320:213–216

Bouza L, Jaques M, Scotta B, Miginiac E (1994) Relation between auxin and cytokinin contents and in vitro rooting of tree Peony (Paeonia suffruticosaAndr.). Plant Growth Regul 15:69–73

Brauner L, Bukatsch F (1980) Das kleine pflanzenphysiologische Praktikum. Neubearbeitet von Franz Bukatsch. Fischer, Jena

De Klerk G-J, van der Krieken W, De Jong JC (1999) Review. The formation of adventitious roots: new concepts, new possibilities. In Vitro Cell Dev Biol 35:189–199

Fessler A (1980) Gartenstauden. Ulmer, Stuttgart Haensch K-T (1999) Somatic embryogenesis in vitro from adult plants of Pelargonium: influence of genotype and basal medium. Gartenbauwissenschaft 64:193–200

Hay R, Synge PM (1976) Das grosse Blumenbuch, 3rd edn. Ulmer, Stuttgart

Heller R (1953) Recherches sur la nutrition minerale des tissus vegetaux cultives in vitro. Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14:1–223

Jelitto L, Schacht W, Fessler A (1985) Die Freiland Schmuckstauden. Ulmer, Stuttgart

Koblitz H (1972) Zell-und Gewebezüchtung bei Pflanzen. Fischer, Jena

Lim CC, Kitto SL (1995) Micropropagation of Helleborus orientalis Lam. and Aconitum uncinatumLinn. (Ranunculaceae). Hort Science 30:871

McLewin W, Mathew B, Schmiemann G (1995) HelleborusWildarten (I). Gartenpraxis 7:14–18

Morzadec JM, Hourmant A (1997) In vitro rooting improvement of globe artichoke(cv. Camus de Bretagne) by GA3 . Sci Hortic 72:59–62

Pierik RLM, Oosterkamp J, Ebbing MAC (1997) Factors controlling adventitious root formation of explants from juvenile and adult Quercus robur'Fastigiata'. Sci Hortic 71:87–92

Rupprecht H, Miessner E (1985) Zierpflanzenbau. VEB Deutscher Landwirtschaftsverlag, Berlin

Schmiemann G (1996)Helleborusals Zuchtpflanzen: Rückschau und Ausblick auf die Zucht der Helleborus. Zierpflanzenbau 2:61–64

Seyring M (1996) Untersuchungen zur In-vitro-Vermehrung von Ptilotus exaltatus. Gartenbauwissenschaft 61:70–76

Seyring M (2000) Mikrovermehrung bei Paeonien. Das TASPO magazin, vol 2. Thalacker Medien, Braunschweig, pp 30–31

Sharma SK, Ramamurthy V (2000) Micropropagation of 4-yearold elite Eucalyptus tereticornistrees. Plant Cell Rep 19:511–518

Springer P (1995) DE/GA Ausstellungen – IPM. Dtsch Gartenbau 8:477

Có thể bạn quan tâm: 

1. Tái sinh cây hoa hồng chuyển gen (Rosa hybrid) từ mô sẹo phát sinh phôi
https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/hoa-chat-dung-cu-nuoi-cay-mo-thuc-vat/tai-sinh-cay-hoa-hong-chuyen-gen-rosa-hybrid-tu.aspx


Trâm Anh 
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com