Tham khảo giá Vitamins cho nuôi cấy mô
 

   Vitamin kết hợp với các thành phần khác trong môi trường cho thấy những tác động trực tiếp và gián tiếp lên sự phát  triển tạo sẹo(callus), sự phát triển của tế bào, sự phát triển của phôi. Ví dụ, các nghiên cứu khác nhau đã chỉ ra rằng thiamin có liên quan đến cytokinin và có vai trò kích thích sự phát triển tạo sẹo(callus) và sự tạo rễ. Hơn nữa, thiamine rất cần thiết trong việc tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp như protease trong dứa. Cả biotin và riboflavin đóng một vai trò trong việc phát triển callus. Đặc biệt, riboflavin có tác động khác nhau đến tạo rễ dù tích cực hay tiêu cực. Vitamin D được biết có tác động đến sự hấp thu canxi trong mô động vật, có tác dụng trên thực vật cũng tương tự. Ngoài ra, vitamin D làm kéo dài tế bào và phân chia tế bào mô đỉnh sinh trưởng. Vitamin C được biết đến với tính chất chống oxy hoá, cũng làm tăng sự phát triển của chồi và rễ.
 

Giới thiệu:
 

   Thực vật là một nguồn cung cấp vitamin cần thiết cho con người và động vật. Chức năng và các con đường tổng hợp của chúng đã được nghiên cứu rộng rãi. Sinh tổng hợp vitamin trong thực vật chủ yếu được sử dụng làm chất trung gian thiết yếu trong các phản ứng sinh hóa hoặc như chất xúc tác trong các con đường khác nhau. Các vitamin được chia thành hai nhóm chính, hòa tan trong nước (Ascorbic acid "C", thiamine "B1", riboflavin "B2", pyridoxin "B6", acid nicotinic, cobalamin "B12", axit folic, axit pantothenic "B5" , Biotin) và vitamin tan trong chất béo (A, D, E, K) [1]. Theo Bonner [2], việc nghiên cứu các vitamin trong nước có lợi ích cao hơn các vitamin tan trong chất béo. Trong nuôi cấy mô, một số cây trồng có thể thiếu vitamin [3]. Do đó, bổ sung ở nồng độ thích hợp cho các mô thực vật cần thiết để có được sự tăng trưởng. Các yêu cầu về nồng độ vitamin của tế bào thực vật khác nhau tùy theo loài thực vật và loại hình nuôi cấy.
 

   Thiamine pyrophosphate (TPP) là dẫn xuất của Thiamine (Vit B1) [1]. Chức năng sinh lý của Thiamine trong thực vật rất đa dạng và đóng vai trò đồng thời trong các phản ứng enzym bao gồm con đường pentose phosphate, glycolysis, chu trình axit tricarboxylic (TCA), complex pyruvate dehyrdrogenase, transketolase, và pyarvate decarboxy lase [4]. Pyruvate decarboxylase là thành phần bắt buộc trong sản xuất năng lượng ở Arabidopsis [5]. Thiamine có liên quan đến khả năng kháng bệnh và biểu hiện gen PR-1 từ việc kháng thuốc, nhưng không kháng thuốc hệ thống (SAR) [6], tuy nhiên Ahn et al. [7] cho thấy SAR gây ra ở Arabidopsis. Trong điều kiện stress abiotic ở Arabidopsis, thiamine nội sinh tăng lên đáng kể để đối phó với các stress oxy hóa bằng cách cung cấp NADH và NADPH. Vitamin C hoặc ascorbate bị oxy hoá bởi oxy, hydrogen peroxides, và superoxides thành các gốc tự do monodehydroascorbate (MDHA). Ascorbate oxidase có thể liên quan đến sự dãn thành tế bào và tăng trưởng. MDHA, một sản phẩm của ascorbate oxidase, các gốc tự do thu được sự khử cực màng tế bào do đó dẫn đến sự hấp thu ion và sự nới lỏng thành tế bào [9]. Các vitamin khác như riboflavin, tiền thân của coenzyme FAD và FMN, axit nicotinic - tiền chất của NAD và NADP, tham gia vào các phản ứng oxi hóa tế bào. Trong bài tổng quan này, chúng tôi sẽ cung cấp một bản tóm tắt cơ bản về các con đường này, ở cấp độ vĩ mô, khi bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy mô thực vật.
 

Các vitamin trong nuôi cấy mô
 

   Trong môi trường nuôi cấy mô, thiamine, acid nicotinic, pyridoxine và myo-inositol trong môi trường Murashige và Skoog (MS) thường bổ sung ở các nồng độ tương ứng 0.1 mg·l–1, 0.5 mg·l–1, 0.5 mg·l–1, and 100 mg·l–1, trong khi các vitamin khác thì có thể không cần. Myo-inositol vẫn là một hợp chất gây tranh cãi, được phân loại là vitamin tan trong nước hoặc như một loại đường [3]. Các nghiên cứu trước đây trong phôi hạt đậu do Ray thực hiện đã chỉ ra rằng sự tăng trưởng in vitro bằng cách tăng hàm lượng vitamin C. Phát hiện này không thể được áp dụng rộng rãi vì một số cây không cần tăng nồng độ vitamin C, cho thấy các cây khác tự dưỡng nhiều hơn (cà chua và yến mạch) [2]. Cũng nhận thấy rằng việc bổ sung biotin làm tăng trọng lượng khô của đậu Hà Lan, tương tự phản ứng ở cây Ricciocarpus khi nghiên cứu axit pantothenic. Không giống như các vitamin khác, thiamine bổ sung cho phôi đậu trong ống nghiệm ảnh hưởng đồng thời đến việc tạo rễ và sự phát triển chồi. Các nghiên cứu in vitro cho thấy rễ cà chua có khả năng biểu hiện kéo dài rễ phụ thuộc vào thiamine. [2].
 

Vi nhân giống:
 

   Với sự có mặt của 25 mg/l vitamin D3 trong vi nhân giống cây con khoai tây cho thấy hiệu quả hấp thụ Ca2 + [12]. Tuy nhiên, nồng độ vitamin D3 cao hơn 25 mg/ l như 50 mg/ l không kích thích mức hấp thụ cao hơn. Mặt khác vitamin D2 ức chế sự hấp thu Ca2 +. Kết luận rằng kết hợp cả hai vitamin D2 và D3 không cải thiện sự hấp thu canxi do đó khẳng định sự vượt trội của vitamin D3 đối với sự hấp thu canxi [12].

Tăng trưởng callus và tế bào sinh dưỡng
 

   Gamborg et al. [13] nuôi cấy tế bào rễ đậu tương trên một số môi trường có nồng độ thiamine khác nhau, và với môi trường nuôi cấy B5 hoàn chỉnh. Một lượng tế bào đậu nành nuôi cấy ban đầu là 53 mg đã được trồng ở các nồng độ thiamine 0 mg/ l và 10 mg/ l. Sau 5 ngày, đã tạo ra được 138 mg và 203 mg tế bào đậu nành. Pyridoxine, acid nicotinic và myo-inositol trong môi trường không có tác dụng bất lợi riêng lẻ đối với sự tăng trưởng. Do đó, Gamborg và cộng sự [13] đã kết luận sự cần thiết phải cung cấp thiamine cho môi trường để duy trì sự phát triển của tế bào rễ đậu nành.
 

   Eriksson đã kết luận rằng axít nicotinic và pyridoxine là những vitamin cần thiết đi cùng với thiamine khi nghiên cứu sự tăng trưởng tối ưu của Haplopappus gracilis Nutt. trên môi trường MS cải tiến [10].

Polikarpochkina et al. [15] báo cáo rằng mô sẹo ngô giảm từ 110 mg / ml xuống còn 3 sau khi loại bỏ thiamine. Tuy nhiên, việc loại bỏ inositol và pyridoxine trong môi trường MS [10] không có sự khác biệt đáng kể về sự phát triển [15]. Sự thay đổi được ghi nhận từ đoạn đầu tiên đến giai đoạn thứ ba, khi không bỏ inositol và pyridoxine ghi nhận lần lượt là 9% và 2.5%.
 

   Digby và Skoog [16] đã phát hiện ra mối liên quan giữa kinetin và thiamine trong sự nuôi cấy callus thuốc lá bình thường. Nó đã được chỉ ra rằng kinetin cao là cần thiết để tổng hợp thiamine trong trường hợp không thêm vào bất kỳ thiamine ngoại sinh. Tuy nhiên, tăng trưởng bền vững trên môi trường kinetin thấp là không thể trừ khi thêm vào thiamine. Trong khi đó, Linsmaier và Skoog [17] duy trì nuôi cấy thuốc lá với 1000 μg / l kinetin và nil thiamine trên 17 lần cấy chuyền. Dravnieks và các cộng sự xác nhận rằng tổng hợp thiamine là cơ chế điều khiển phản hồi nên nhạy cảm với nồng độ thiamine trong mô, dù bất kỳ nồng độ kinetin.
 

   Cả hai thiamine và biotin đều có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển callus của cây chà là [19]. Tăng thiamine từ 0.1 mg/ l đến 0.5 mg /l làm callus tăng trưởng tối đa; hơn nữa, tăng thiamine lên 2 mg /l làm giảm trọng lượng callus. Hơn nữa, tăng biotin từ 0 đến 1 mg/ l cho thấy trọng lượng callus tối đa tương tự như thiamine [19]. Mặt khác, một báo cáo trước đó của Drew và Smith [20] cho thấy sự hiện diện của riboflavin làm giảm sự tăng trưởng callus đu đủ. Sự giảm đáng kể trọng lượng callus trung bình được ghi nhận từ 89,32 mg đến 0,10 mg cho mỗi mẫu cấy, khi có và không có riboflavin, [20].
 

   Axit ascorbic hoạt động chủ yếu như chất chống oxy hoá, được sử dụng để ngăn ngừa hóa nâu của mô [1,3]. Tuy nhiên, trong tế bào thuốc lá, axit ascorbic đã được chứng minh là có tác dụng kích thích sự phân bào [21].
 

Tạo rễ:
 

   Vitamin D3 kích thích tạo rễ Phaseolus vulgaris L. trong nuôi cấy [22]. Trong nghiệm thức đối chứng mà không có bất kỳ vitamin 43.75% rễ dài hơn 14 mm, trong khi bổ sung vitamin D3 đạt 78,75%. Ảnh hưởng của vitamin D3 được Boland và các cộng sự [22] ở 10-9 M, sự phát triển của rễ có liên quan đến sự hấp thu của ion canxi, sự kéo dài tế bào trong vùng rễ ở 0,5-1 mm từ đỉnh, và sự kích thích phân chia tế bào đỉnh sinh trưởng.

Tạo rễ in vitro của gốc đào lai GF677 (Prunus amygdalus × P. persica Batsch.) được nghiên cứu bằng cách bổ sung các nồng độ khác nhau của riboflavin từ 0 đến 2,0 mg / l [23]. Khi riboflavin thêm nhiều thì sự tạo rễ giảm tuyến tính cho đến khi nó được ức chế hoàn toàn. Nồng độ nhỏ nhất 0,5 mg/ l của riboflavin làm cho số lượng trung bình, chiều dài, trọng lượng tươi và trọng lượng khô giảm mạnh [23]. Trong khi, 1,5 và 2 mg/ l riboflavin gây ra triệu chứng vàng lá và hoại tử xuất hiện. Hơn nữa, sự hình thành rễ bất định dài và nhỏ, trong khi ở môi trường cải tiến, rễ ngắn và dày. Ngoài ra, sự hình thành callus bị ức chế trong môi trường MS tạo rễ, do tác động ức chế của auxin bởi tán sắc ánh sáng [23].
 

   Ngược lại, riboflavin đã được chứng minh là kích thích và giúp rễ phát triển đáng kể [24-26]. Sự tạo rễ trong nuôi cấy mô cây táo đã được nghiên cứu với sự hiện diện của riboflavin. Trong tối riboflavin kích thích sự phát triển của rễ cây với sự hiện diện của auxin (IBA), khả năng tạo rễ giảm khi loại bỏ vitamin và có ánh sáng [24]. Trindade và Pais [25] cho thấy Eucalyptus globulus Labill. đã tạo ra 80% khả năng tạo rễ trên môi trường De Fossard cải tiến có riboflavin (Bảng 1). Mặt khác, 60% rễ hình thành trên cùng một môi trường trừ hợp chất sau [25]. Sự hình thành rễ Carica papaya L. tối ưu khi 31 μM riboflavin và 10 μM IBA đã được thêm vào môi trường De Fossard để ở điều kiện tối 2 ngày, nhưng điều đó gây ra tác động tiêu cực [26]. Tuy nhiên, Drew et al [26] tìm ra cachs hạn chế tác động tiêu cực của IBA gây ra khi có ánh sáng. Việc tiêm riboflavin ở 300 μM / ml vào 10 ml môi trường, tương đương với nồng độ riboflavin tối ưu là 31 μM, sau 1 ngày để môi trường IBA trong ánh sáng [26].
 

   Thiamine là một loại vitamin khác cho thấy khả năng tạo rễ đáng kể trên pacific yew, một loài cây thường xanh, Taxus brevifolia Peattie [28]. Sau khi thêm thiamine, Chee et al. [28] thu được 61,5% số rễ bất định ở T. brevifolia Peattie so với 30% không có thiamine. Trong tổng quan tài liệu nhân giồng Eucalytus, vitamin E, không phải là chất chống oxy hoá, ảnh hưởng đến sự tạo rễ và đẩy nhanh tiến trình tạo rễ khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy [29].
 

Sự phát triển của phôi và cơ quan:
 

   Thiamine vaf acid nicotinic có hiệu quả đồi với phôi [30]. Barwale et al [30] nghiên cứu hiệu quả các nồng độ khác nhau cũa vitamin lên 40 phôi đậu nành chưa trưởng thành trên môi trường MS cải tiến [10]. Thiamine ở nồng độ 1.0 μM hoặc hơn, tạo ra 68% phôi so với nồng độ 0.2 μM tạo ra 33% phôi. Ngoài ra, nồng độ 32,4 μM axit nicotinic tạo 76% phôi [30].
 

   Asano và cộng sự [31] cho thấy việc tăng cường phôi callus của Zoysia japonica Steud, một loại cỏ ấm mùa hè có nguồn gốc từ Nhật Bản, đạt được bằng cách thêm thiamine và riboflavin vào môi trường. Khi thiamine không được bổ sung vào môi trường thì chỉ thu được 50,3% callus, ngược lại, 0,4 và 4 mg/ l cho 53 và 60,3% tương ứng nhau, không cho sự khác biệt nào. Hơn nữa, riboflavin không có hiệu quả khi bổ sung riêng lẻ, trừ khi có thiamine ở nồng độ 4 mg/l hoặc cao hơn [31].
 

   Thiamine và biotin là những thành phần thiết yếu của môi trường nuôi cấy mô để tối ưu hóa sự phát triển phôi cây chà là (Pheonix dactylifera L.) [19]. Ảnh hưởng của thiamine đã được chứng minh là phụ thuộc vào biotin để tối ưu số lượng phôi somatic, Bonner cũng đề cập về vấn đề này. Số lượng phôi soma thu được cao nhất ở nghiệm thức 0,5 hoặc 2 mg / l thiamine và 2 mg /l biotin. Tuy nhiên, nồng độ tối ưu nuôi cấy phôi là môi trường chứa 0,5 mg/ l thiamine và 2 mg /l biotin. Sự phát triển của phôi cũng bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa biotin và thiamin. Độ dài phôi tối đa đạt được tại 0,5 hoặc 2 mg / l thiamine và 1 mg / l biotin [19].
 

   Pérez et al. [32] đã nghiên cứu ảnh hưởng của thiamine và các hợp chất khác đối với sự bài tiết protease trong nuôi cấy dứa. Lượng thiamine ngoại sinh trong khoảng từ 0,3 đến 1,2 μM có ảnh hưởng tiêu cực đến khối lượng tươi của dứa, hình thành nên một cao nguyên (forming a plateau) [32]. Mặt khác, thiamine sản xuất hàm lượng protein tối đa ở 0,6 μM, trong khi proteolytic và proteolytic đặc biệt hoạt động ở cả 0,3 μM [32].
 

   Trọng lượng chồi của đu đủ tăng đáng kể khi có cả cytokinin và riboflavin, so với môi trường chỉ có cytokinin [20]. Trong khi trọng lượng chồi giảm khi có sự hiện diện của riboflavin và auxin, có thể liên quan đến quá trình oxy hóa auxin do ánh sáng, cũng được Gorst et al. [33] đề cập trên Eucalyptus ficifolia F. Muell, kết quả tương tự khi so với môi trường chỉ chứa auxin [20]. Ngoài ra Drew et al. [34] báo cáo rằng nồng độ auxin (Indole-3-butyric acid) ở 10 μM có thể nhiều hơn hoặc ít hơn, nhưng không có ảnh hưởng trong khi 1 μM riboflavin tạo rễ tỷ lệ nhỏ. Hơn nữa, tăng nồng độ của riboflavin từ 0.1,1, đến 10 μM, giảm IBA và điều kiện có ánh sáng [34]. Khi 10 μM IBA được sử dụng, sự phá huỷ IBA xảy ra sau 16 ngày tương ứng 2 ngày khi không và có riboflavin, trong ánh sáng [34].
 

   Ứng dụng ngoại sinh của 8x10-4 M và 4 - 8x10-4 M ascorbate lên môi trường hình thành chồi tăng tăng 45% và 450% khi sử dụng mô sẹo callus non (4-12 cấy chuyền) và callus già (> 30 cấy chuyền) của thuốc lá (Nicotiana tabacum L) tương ứng, sau 35 ngày nuôi cấy [35]. Trong môi trường không không tạo chồi, có chứa axit gibberellic, sự tăng trưởng của chồi từ callus non có ý nghĩa ở mức 4 × 10-4 M và hầu như không đáng kể đối với callus già [35]. Hiện tượng trước đây chỉ ra một hành động ức chế bởi ascorbate trên axit gibberellic. Ngoài ra, acid ascorbic làm giảm thời gian tạo chồi sơ khởi [35].
 

   Roest và Bokelmann đã cho thấy rằng một số lượng lớn các chồi bất định và các chồi chuyển tiếp của Chrysanthemum thu được khi có vitamin trong môi trường MS hoàn chỉnh [36]. Trong khi đó, một môi trường không có vitamin ức chế sự hình thành chồi mặc dù tất cả các khoáng chất khác không đổi [36].
 

   Ngược lại, việc loại bỏ vitamin (thiamine, pyridoxine, nicotinic acid, folic acid và biotin) khỏi môi trường Bourgin và Nitsch [37] in vitro không ảnh hưởng đến 16 giống cây, trừ sự hình thành chồi và rễ của Begonia x hiemalis [38 ]. Ngoài ra, Soczek và Hempel nghiên cứu việc nhân giống 3 giống Gerbera với sự có mặt và không có thiamine, pyridoxine, nicotinic Axit và các hợp chất khác. Kết luận rằng nồng độ giảm, xuống còn nửa hoặc một phần tư của môi trường Murashige et al. [40], loại bỏ các vitamin không có ý nghĩa về sự tăng trưởng trên ba lần cấy chuyền (mỗi 4 tuần), ngoại trừ trường hợp của một giống cây cần acid nicotinic [39].
 

Kết luận:
 

   Các vitamin nên được nghiên cứu sâu hơn để chứng minh cho sự bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Ví dụ, vai trò của vitamin E (α-tocopherol) ít được biết đến, chất chống oxy hóa phenol, hiện diện trong môi trường nuôi cấy. Trong vài thập niên gần đây, ít quan tâm đến việc nghiên cứu một số vitamin nhất định như biotin và acid pantothenic. Các loài thực vật và giống cây trồng đòi hỏi lượng vitamin khác nhau, trong khi các loài khác lại cần đến. Ví dụ, sau vài lần cấy chuyền, thiamin là thiết yếu đối với đậu nành, gạo, và thuốc lá nhưng không cần thiết đối với các tế bào lạc vốn có sẵn nồng độ thiamine cao [41]. Khi sử dụng cùng một loại vitamin, sinh lý và hình thái học khác nhau giữa các cây trồng. Theo kết quả mong muốn của chúng tôi môi trường nuôi cấy vẫn cần những sửa đổi, đặc biệt môi trường MS thông thường [10]. Mặc dù sự hiện diện của vitamin như thiamine bắt buộc trong môi trường nuôi cấy, những chất khác ít ứng dụng hơn như acid ascorbic.
 

   Kiến thức khoa học về nhân giống cây trồng không phải là kết quả quan trọng duy nhất; tuy nhiên, một số thí nghiệm đưa ra các giải pháp kinh tế. Để giảm chi phí, Drew et al. [27,34] đề nghị bổ sung riboflavin vào các môi trường nuôi cấy hơn là bổ sung cho mô chất kích thích tố (để giảm auxin). Trong tương lai, nghiên cứu ảnh hưởng trên một phạm vi rộng hơn của vitamin và cây trồng đồng thời là cần thiết nâng cao một kết quả khả thi.

Ref: American Journal of Plant Sciences, 2011, 2, 669-674

doi:10.4236/ajps.2011.25080 Published Online November 2011 (http://www.SciRP.org/journal/ajps)

Peter Abrahamian, Arumugam Kantharajah

Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com