Friable embryogenic tissue (FET)- Mô xốp phát sinh phôi được khôi phục từ nuôi cấy dây hoa hồng, Rosa hybrid cv. Royalty, và đồng nuôi cấy với Agrobacterium tumerfaciens hay A.rhizogene có vector chứa các gen neomycin phosphotransferrase II (NPTII) và -glucuronidase (GUS) hay firefly luciferase (LUC). Các cụm giả định được chuyển gen được chọn lọc trên kanamycin. Năm mươi – sáu mươi dòng mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được tái sản xuất từ mỗi gam FET đã nuôi cấy với Agrobacterium. Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi chuyển gen được chuyển vào môi trường trưởng thành để hình thành phôi sinh dưỡng, và sau đó tạo ra cây hoa. Sự chuyển gen tự nhiên ở thực vật được xác nhận bởi phân tích enzyme, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và lai Southern. Khoảng 100 cây chuyển gen được thiết lập trong đất và ra hoa trong nhà kính. Phương pháp này tạo điều kiện giới thiệu gen mong muốn, đặc biệt những gen điều khiển màu hoa, trong các giống hoa hồng thương mại.

 

Khả năng hiệu quả để chuyển gen mong muốn vào các giống hoa cắt cành có giá trị kinh tế có sự liên quan đến sự cải tiến của chúng. Các đặc tính như màu hoa, hình dáng hoa, tươi lâu, đặc tính cây và tính kháng bệnh và côn trùng được cải tiến thông qua sử dụng kỹ thuật chuyển gen. Hiện tại, phân tích gen và thao tác gồm gia tăng kiến thức trong sinh tổng hợp sắc tố ở dạ yên thảo [1], ức chế sinh tổng hợp ethylene ở cà chua [2], và giảm khả năng nấm gây bệnh ở thuốc lá [3] đã mở ra con đường mới để tái sinh các giống hoa lạ.

 

Hoa hồng là cây làm cảnh quan trọng trên thế giới [4]. Hoa hồng hiện nay (hybrid teas) được phát triển thông qua gieo hạt và chọn lọc. Tuy nhiên, cải tiến hoa hồng rất khó để có thể đạt được thông qua phương pháp gieo hạt vì dị hợp tử ở mức độ vô sinh cao gây ra bởi phạm vi rộng của số NST [5]. Thêm vào đó, các đặc điểm làm vườn của hoa hồng có bộ gen giới hạn. Ví dụ, hoa hồng không có khả năng di truyền cho sản xuất giống trong phổ màu đầy đủ (vd. hoa hồng xanh).

 

Không có bất kỳ báo cáo nào trong các tài liệu chuyển gen hoa hồng. Tuy nhiên, có một vài báo cáo trong tái sinh [6-10]. Hiệu quả tái sinh cây trong hầu hết các báo cáo [7-10] về khả năng tái sản xuất chưa được biết đến. Vì vậy, ứng dụng của các quy trình tái sinh về chuyển gen hoa hồng là hạn chế. Noriega và Sondahl [6], tuy nhiên, sản xuất mô rời rạc có khả năng tạo phôi (FET) có thể tái sinh cao của Rosa hybrid cv. Royalty. Ở đây, chúng tôi kết hợp quy trình của họ với kỹ thuật lạ cho phương tiện chuyển gen Agrobacterium. Ngược lại với các hệ thống chuyển gen Agrobacterium, phương pháp này không yêu cầu tạo vết thương. Chuyển gen với hiệu quả cao, có khả năng tái sinh và áp dụng cho mô sẹo phát sinh phôi của hoa hồng.

 

 

Duy trì và bảo quản lạnh mô xốp phát sinh phôi(FET).  Mô được duy trì như mô tả [6]. Một cách khác để cung cấp nguồn ổn định của FET ở các nghiên cứu giới thiệu về gene trong tương lai, mẫu FET được đông lạnh trong nito lỏng. Sau khi rã đông, mô được nuôi cấy trên môi trường N9-N12 [6]. Các mô tạo phôi sinh dưỡng và tái sinh chồi ở cùng mức và hiệu quả như mẫu đối chứng không đông lạnh (Firoozabady và cộng sự, trong phần chuẩn bị).

 

Chuyển gen. Trong các thí nghiệm sơ bộ, dòng Agrobacterium tumerfaciens LBA4404 (TLTK 11) được dùng để cấy cho các mẫu ban đầu khác nhau như mô thân, cuống, lá và hoa, nhưng kết quả là tạo mô sẹo biến đổi gen, khối chắc và không thể tái sinh. Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng FET như vật liệu ban đầu. Chuyển gen của FET được tiến hành với Agrobacterium tumerfaciens LBA4404 mang vector nhị phân pJJ3931 (nosNPTII/35SLUC) hay Agrobacterium rhizogenes dòng 15834 (TLTK 12) mang vector nhị phân pJJ3499 (nosNPTII/35SGUS) [13]. Năm mươi ngày nuôi cấy, các phần chuyển gen, dựa vào phân tích GUS (Hình 1A), được quan sát trên cấu trúc cầu của mô phát sinh. Các mô nuôi cấy 4 tuần trên môi trường chọn lọc để tạo mô sẹo, màu kem, rời rạc, đường kính kháng kanamycin khoảng 3mm màu nâu, các mô bị chết (Hình 1B). Năm mươi – sáu mươi mô sẹo kháng kanamycin được khôi phục ở mỗi gam mô được nuôi cấy với Agrobacterium. Tất cả mô sẹo tăng trưởng trên môi trường không có kanamycine; mẫu đối chứng không chuyển gen không thể phát triển trên môi trường có kháng sinh. 

Agrobacterium tumerfaciens và Agrobacterium rhizogenes tạo ra mô sẹo kháng kanamycin ở cùng tần suất. Các thí nghiệm sau nhiều mô sẹo kháng kanamycin đạt được khi cấy FET trải mỏng (500mg FET/đĩa) trên môi trường được chọn. Một trăm phần trăm mô sẹo kháng kanamycin được chuyển gen dựa trên biểu hiện của gen GUS (Hình 1C). Không có gen GUS hoạt động được loại bỏ từ các mô nâu hay mô sẹo đối chứng âm tính. Mô sẹo biến nạp được cấy chuyền trên môi trường tương tự, có hoặc không có kanamycin, cho nhân giống sau này. Các tác nhân chọn lọc khác bao gồm chlorsulfuron (10μg/l) và hygromycin (50mg/l) cũng cho kết quả với FET hoa hồng chuyển gen. Hai tháng sau khi đồng nuôi cấy, carbenicillin không bổ sung trong môi trường môi cấy (nguyên văn là “carbenicillin was omitted in the culture medium”). Không có trường hợp nhiễm Agrobacterium được quan sát sau này trong suốt quá trình nuôi cấy.

 

Vết thương, trước khi lây nhiễm với Agrobacterium, không cho hiệu quả chuyển gen, tuy nhiên khi có acetosyringone (AS) trong môi trường đồng nuôi cấy (Quy trình thí nghiệm) tăng hiệu quả chuyển gen gấp 5 lần (57 mô sẹo kháng kanamycin trên mỗi gam FET khi so với 12).

Chúng tôi dùng Agrobacterium rhizogenes EHA 101 (TLTK 14) chứa vector pJJ3499 (TLTK 13) cho chuyển gen FET hoa hồng và đạt được kết quả tương tự (dữ liệu không hiển thị).

 

 

Phát triển phôi và chồi. Sự phát triển phôi (Hình 1D) đã được mô tả [6]. Khi chuyển phôi trên môi trường R, lá mầm mở rộng 5-10 lần, phôi tăng kích thước 3-5 lần và tạo ra phần xanh dưới ánh sáng. Các phần tạo chồi trong 8 tuần. Khi cấy chuyền trên môi trường tương tự chồi nhân lên (Hình 1E), và chồi được kéo dài (thân 7-15 mm) với 5-8 lá được quan sát thấy trong 8-12 tuần. Tổng 5-30 chồi trên một phôi gốc được tạo thành trong 20 tuần trên môi trường R.

Hình 1. Chuyển gen của Rosa hybrida cv. Royalty. (A) Các phần chuyển gen GUS dương tính ở các cấu trúc cầu 15 ngày sau khi cấy. (B) FET được chuyển gen xuất hiện như các phần màu kem trên mô sẹo nâu không chuyển gen ở phần sau. (C)  Nhân nhanh các cấu trúc cầu cho thấy GUS hoạt động. (D) Phôi sinh dưỡng trưởng thành cho thấy GUS dương tính (trái) và các phôi không chuyển gen (phải) GUS âm tính. (E) Các chồi phục hồi trên môi trường R. (F) Các chồi tạo rễ thôi qua sử dụng nắp Sorbarod trong khối GA-7. (G) Cây hoa hồng chuyển gen khi ra hoa.

 

Tạo rễ và chuyển ra đất. Tạo rễ của phôi sinh dưỡng bắt nguồn từ chồi (Quy trình thí nghiệm) khởi đầu khó khăn. (1) Sử dụng chậu Jiffy chỉ 10-15% chồi tạo rễ. Các chồi còn lại bị mất lá, hóa nâu và thậm chí bị chết. (2) Sử dụng môi trường 2N, khoảng 50% chồi khởi tạo rễ trong 10-12 ngày. Khi chuyển các chồi được tạo rễ này ra đất, cây hoàn chỉnh được đặt trong nhà kính. Các chồi còn lại tạo mô sẹo ở phần gốc và bị mất lá. (3) Chuyển trực tiếp ra đất sau khi nhúng vào RooTone cho kết quả thành công ở mức 30%. (4) Sử dụng phích cắm Sorbarod khoảng 80% chồi tạo rễ trong 3-4 tuần (Hình 1F). Nhìn chung, số chồi lớn (với thân dài 7-10mm) tạo rễ hiệu quả hơn các chồi nhỏ. Một trăm phần trăm cây có rễ sống sót khi chuyển ra điều kiện nhà kính. Cây cho hoa trong 4-6 tuần sau khi chuyển ra đất (Hình 1G).

 

Phân tích GUS và LUS. Phân tích hóa GUS, và trong một thí nghiệm phân tích LUS, đã được sử dụng để xét nghiệm (nguyên văn: screen) cho sự chuyển gen. Mô ở các giai đoạn phát triển, từ 18-80 sự kiện chuyển gen độc lập được phân tích. Hầu hết tất cả mô sẹo rời rạc (93-100%), cấu trúc cầu (100%), phôi sinh dưỡng (98-100%), chồi (100%) và cây (100%) được kiểm tra khi được chuyển gen. Trong các giai đoạn khác nhau của sự phát sinh phôi và các chồi non, biểu hiện GUS mạnh trong tất cả các tế bào. Trong giai đoạn trưởng thành, cây chuyển gen thành công ra hoa, biểu hiện GUS được tìm thấy ở rễ, lá, bao phấn, chỉ nhị, vòi nhụy và đầu nhụy, noãn và thực giá noãn (Hình 2), cũng như thân, cuống hoa, cánh hoa, lá đài, đế hoa và hạt phấn non (số liệu không hiển thị). Ở các phần trưởng thành của cây biểu hiện GUS được tập trung ở mô mạch (ví dụ Hình 2E). Mẫu tương tự của vị trí GUS được báo cáo ở thuốc lá [15] và hoa cẩm chướng [16].

 

Xác nhận sự chuyển gen. Khi không thể đánh giá sự phân ly giống, các phương pháp khác trong xác nhận chuyển gen hoa hồng được ứng dụng. PCR được tiến hành trên chín cây chuyển gen, tất cả cho thấy đoạn khuếch đại 357 bp mong muốn trong gen NPTII (4). Các kết quả này cho biết sự hiện diện của gen NPTII ở các cây chuyển gen.

 

Hình 3 trình bày phân tích bộ gen Southern của các sự kiện tích hợp T-DNA. Khi HindIII nhận ra vị trí đơn trên cả plasmid 29kb, trong T-DNA, rõ ràng rằng các đoạn DNA nhỏ hơn này cũng cho thấy các sự kiện tích hợp và không có plasmid DNA trong lây nhiễm Agrobacterium có hệ thống. Sử dụng HindIII digestion (emzyme thủy giải HindIII) và dò với các đoạn mép có trình tự NPTII được tìm ra; số band lai cung cấp sự đánh giá số bản sao T-DNA tối thiểu. Mẫu lai cho HindIII phân loại cây 052 và 035 đưa ra giả thiết nhiều đoạn chèn. Các cây 059-1 và 059-2 được bắt nguồn từ cùng một phôi sinh dưỡng, chúng có các kiểu T-DNA giống nhau. Điều này cho giả thiết rằng chúng bắt nguồn từ 1 tế bào đơn tùy thuộc vào sự kiện chuyển gen đơn cho gen NPTIII.

Sự hiện diện của GUS trong các cành và cơ quan khác nhau của cùng 1 cây (dữ liệu không thể hiện) cho thấy rằng các cây này không chimeric (mô tả thể khảm vậy,). Các cây được thực hiện trong ghép cây/nhân giống trong nhà kính và duy trì các đặc tính chuyển gen của chúng (dữ liệu không thể hiện).

Hình 2. Biểu hiện GUS ở cây hoa hồng chuyển gen trưởng thành. (A) Lá non, (B) Rễ non, (C) Đầu nhụy và vòi nhụy, (D) Bao phấn, (E) Bầu và noãn, (F) Chỉ nhị.

 

 

Chúng tôi đã dùng mô xốp phát sinh phôi(nguyên văn: friable embryogenic tissue – FET) bắt nguồn từ nuôi cấy chỉ nhị (6) như là vật liệu khởi đầu cho sự chuyển gen. Dựa vào sự tương đồng giữa FET trong các cây hoa hồng khác nhau, chúng tôi tin rằng sự hiện diện của hệ thống chuyển gen và tái sinh có thể ứng dụng ở bất kỳ cây hoa hồng nào mà FET có thể được tái tạo. Hiện tại, trong phòng thí nghiệm của chúng tôi FET đã được tạo ra cho các cây hoa hồng thương mại khác bao gồm Melody, Mr.Lincoln và Jacaranda (Firoozabady, Noriega vaf Sӧndahl, các kết quả chưa được công bố).

 

Sự lựa chọn FET như nguồn mẫu cho chuyển gen nhờ trung gian Agrobacteria là rất quan trọng. Mặc dù các mô khác được chuyển gen, các cây không được phục hồi từ kết quả mô sẹo. A.rhizogenes 15834 dùng cho chuyển gen cho hiệu quả như A.tumefaciens LBA4404 và EHA101. Hầu hết tất cả cây có kiểu hình bình thường, và như các cây ghép trên các gốc ghép được duy trì ổn định các kiểu hình bình thường của chúng.

Phương pháp chuyển gen hoa hồng mô tả ở đây có các đặc tính mong muốn. (1) Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi thế hệ thứ nhất đã đạt được, nó có thể được bảo quản lạnh, hay nhân nhanh và tiếp tục sử dụng như nguồn chuyển gen, không mất sự phát sinh phôi (trong thời gian dài 4 năm). (2) Phương pháp đơn giản và không cần nỗ lực cao. Hàng trăm gam của FET hoa hồng có thể cấy trên thí nghiệm đơn, và nhiều cây chuyển gen có thể được tạo ra dễ dàng. (3) Phương pháp có tính tái tạo và hiệu quả; 50-60 dòng mô sẹo có khả năng phát sinh phôi kháng kanamycin đạt được trên 1 gam mô nuôi cấy với Agrobacterium và khi tất cả các dòng kháng kanamycin được chuyển gen báo cáo viên không trực quan (nguyên văn “no visual reporter) gen được yêu cầu xác nhận các vật liệu chuyển gen. (4) Ngoài ra, nhiều cây chuyển gen có thể được tạo ra từ các dòng phôi đơn tái biểu hiện bắt nguồn từ các sự kiện chuyển gen đơn. (5) Tất cả các cây chuyển gen kiểm tra đã được chuyển gen đầy đủ, không có cây chimeric được phục hồi đến hiện tại.

Hình 3. (Trên) Bản đồ của đoạn DNA 8.8 kb tích hợp vào pRK290 (TLTK 25) để tạo plasmid pJJ3499 (GUS) hay pJJ3931 (LUC). RB và LB biểu hiện tương ứng ở phần phải và trái của T-DNA. HindIII là vị trí riêng biệt trên plasmid. (Dưới) Phân tích lai Southern của cây hoa hồng chuyển gen. DNA được tách, cắt với HindIII, thấm và lai với vùng trình tự NPTII. Reg đối chứng không được chuyển gen tái sinh các cây đối chứng, WT đối chứng là kiểu cây hoang dã không chuyển gen, và những cái khác là biến đổi gen. Cây 035, 051, 059-1, 059-2, và 065 được chuyển gen với pJJ3499 và cây 044, 052, 054 và 068 được chuyển gen với pJJ3931.

 

Chuyển gen FET lạ trong tạo vết thương , vết cắt hay các thao tác khác không cần thiết cho chuyển gen và không ảnh hưởng trong hiệu quả chuyển gen. Trong các hệ thống khác, tạo vết thương là yêu cầu chung cho phương tiện chuyển gen Agrobacterium. Ví dụ, chuyển gen của phôi sinh dưỡng của cây óc chó (17) và xoài (18) và mô sẹo tạo phôi rời rạc của củ cải đường (19) cũng được bào cáo. Phương pháp chuyển gen cây óc chó yêu cầu vết thương của các phôi riêng lẻ, chuyển gen cây óc chó yêu cầu vết thương ở các phôi riêng lẻ, chuyển gen xoài yêu cầu dầm các mô và quy trình dài để tạo các phôi sinh dưỡng chuyển gen từ các mô chimeric (không đạt được chồi); và quá trình chuyển gen củ cải đường cũng yêu cầu mô sẹo bị cắt thành các mảnh nhỏ sau đó lây nhiễm Agrobacterium. Trong hệ thống hoa hồng, nhân nhanh FET thể cầu và sự hiện diện của các thành phần đang phân chia xuất hiện vừa đủ cho tiến trình chuyển gen (20). Các khu vực sau đó tạo các cấu trúc phôi cầu nhân nhanh (không tạo các giai đoạn gia tăng của phôi) trên môi trường N9-12 và dưới sự chọn lọc tạo đầy đủ các phôi cầu chuyển gen (Hình 1C). Các tác nhân chọn lọc được yêu cầu chỉ trải dài trong tháng đầu của quá trình nuôi cấy, trong khi các hệ thống chọn lọc khác (vd. TLTK 17-19) thì yêu cầu chung trong suốt tất cả các pha của nuôi cấy mô. Thêm vào đó, ở hoa hồng, carbenicillin bị bỏ qua 2 tháng sau khi đồng nuôi cấy và không thấy sự nhiễm Agrobacterium. Điều này vì khác cấu trúc cầu và vi khuẩn được rửa dễ dàng hơn sau khi đồng nuôi cấy. Trong các hệ thống khác (vd. TLTK 17-19). Tuy nhiên, carbenicillin được yêu cầu trong suốt hầu hết hay tất cả các pha nuôi cấy. Thiếu sót kháng sinh và tác nhân chọn lọc có thể tạo mức tăng trưởng nhanh hơn và sự phát triển phù hợp hơn của các phôi sinh dưỡng chuyển gen.

 

Chúng tôi tin rằng quá trình chuyển gen đã mô tả ở đây là phương pháp tổng quan có thể áp dụng cho các hệ thống cây khác để tạo FET (vd, chuyển gen trên cây bông, Engler và cộng sự, chưa được công bố). Trong nhiều hệ thống, việc tạo mô có khả năng phát sinh phôi là 1 sự kiện hiếm. Ví dụ ở hoa hồng, chỉ 2 mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được thu được từ các mẫu chỉ nhị trong nhiều thí nghiệm tiến hành trong 1 nghiên cứu 3 năm (cũng như Firoozabady và cộng sự, kết quả chưa được công bố). Trong nhiều trường hợp, sự phát sinh phôi là hiếm, sử dụng nguồn mẫu hầu như chỉ tạo mô sẹo chuyển gen (vd như nghiên cứu này). Thêm vào đó, các mẫu như chỉ nhị non thậm chí không sống sót trong các nghiệm thức lây nhiễm (Firoozabady và cộng sự, kết quả chưa được công bố). Vì vậy, trong một số hệ thống cây, sử dụng FET như nguồn mẫu có lẽ là con đường duy nhất để tạo ra thể chuyển gen.

Khả năng của hệ thống chuyển gen/tái sinh thể hiện ở đây đã cho phép kỹ thuật dy truyền trực tiếp của Royalty, một loài cây thương mại quan trọng ở Mỹ. Ví dụ, bằng việc chèn 1 gen tổng hợp chalcone hoa hồng chimeric vào cây Royalty, chúng tôi đã phân tích nhiều dòng tạo hoa với cường độ màu giảm đáng kể (Courtney – Gutterson và cộng sự, kết quả chưa công bố). Chúng tôi chờ đợi các cây hoa hồng mới được tạo ra thông qua kỹ thuật dy truyền để thương mại hóa trong thập niên này.

 

 

Duy trì mô có khả năng phát sinh phôi rời rạc. Mô được cung cấp bởi Noriega và Sondahl (6). Mô được duy trì liên tục trên môi trường N9-12 (6) hay được bảo quản lạnh (Firoozabady và cộng sự ở phần chuẩn bị) cho đến khi sử dụng cho việc chuyển gen. Trong nghiên cứu này, tất cả các hormone và kháng sinh được thêm sau khi hấp khử trùng. Các mô được nuôi ở điều kiện tối, 25±1°C cho đến khi các phôi sinh dưỡng được sẵn sàng cho việc nảy mầm.

 

Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium của phôi có khả năng phát sinh phôi. Vi khuẩn được nuôi ở 28°C trong 2 ngày trên môi trường thạch L-Broth (21) chứa các kháng sinh thích hợp cho sự chọn lọc và tạo huyền phú trong môi trường MinA cho sự lây nhiễm khoảng 10mL mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được trộn với 3mL dịch huyền phù vi khuẩn (~5x10⁸ tb/mL) và đặt lên giấy lọc trên môi trường N9-12 chứa 100μM acetosyringone. Trong 1 thí nghiệm, FET được đè với con lăn để kiểm tra hiệu quả của vết thương lên sự chuyển gen. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, mô sẹo được rửa 2 lần với môi trường MS lỏng (22) không có chất điều hòa tăng trưởng chứa carbenicillin (500mg/L) và vancomycin (100mg/L) và để trên môi trường N9-12 có 300mg/L kanamycin và 500mg/L carbenicillin (20-25 miếng, 1.5 mg/đĩa). Một tháng sau khi đồng nuôi cấy, mô sẹo được lấy ra khỏi kanamycin và đặt sang môi trường mới với carbenicillin (500mg/L) để nhân các mô có khả năng phát sinh phôi. Sau này, các mô có thể được duy trì liên tục trên môi trường N9-12 (không có carbenicillin) và cấy chuyền hàng tháng.
 

Sự phát triển phôi và chồi. Sự phát triển phôi như được mô tả (6). Các phôi sinh dưỡng trưởng thành được tiếp tục lấy từ môi trường M134-20 (TLTK 6). Khi chúng đạt kích thước khoảng 4-6 mm và chuyển sang môi trường R cho sự tái sinh. Môi trường này bao gồm muối MS (22), vitamin của môi trường M134-1 (6), BA (3.0mg/L), IAA (0.3 mg/L), gelrite (2.2 g/L), sucrose (30g/L), pH 5.8. Từ quan điểm này, các mô được nuôi 16h chiếu sáng một ngày (30μE/m²/s) ở 25±1°C.

 

Sự phát triển cây con. Trên môi trường R, các phôi được tạo các phần xanh được cắt ra và cấy chuyền mỗi 2-4 tuần trên cùng môi trường để tạo chồi. Chồi được tạo rễ bằng 4 phương pháp khác nhau. (1) Chồi được chuyển sang các chậu Jiffy (Ball Jiffy, West Chicago), được thấm môi trường N₆m. Môi trường này bao gồm ½ X các muối N6 (23), IAA (2mg/L), thiamine HCl (1mg/L), pH 5.5. Trong chậu Jiffy các cây trưởng thành được hình thành trong 4 tuần và sau đó chuyển qua đất. (2) Các chồi được kéo dài được chuyển qua môi trường 2N (giống M134-53 (TLTK 6) nhưng với 2mg/L NAA thay vì ABA và GA₃) trong 10 ngày để khởi đầu sự tạo rễ và sau đó chuyển qua đất để tạo các cây hoàn chỉnh. (3) Các chồi được nhúng trong RooTone (Cooke Lab Products, Portland, OR, USA) và được chuyển trực tiếp ra đất trong phòng tăng trưởng. (4) Các chồi được tạo rễ trong các nắp Sorbarod (Baumgartner Papies SA, Thụy Sĩ) thấm môi trường N₆m bổ sung 30g/L sucrose. Các nắp chứa cây hoàn chỉnh (sau khi rửa nước để làm sạch sucrose) được đặt trực tiếp vào đất, hay các nắp được chuyển để ngăn cản sự lây nhiễm. Các cây con được làm cứng cáp dần và chuyển sang nhà kính.

 

Phân tích sự chuyển gen. Kiểm tra hoạt động -glucuronidase (GUS) được thực hiện theo Ow và cộng sự (24) được cải tiến bằng cách sử dụng quang phổ kế (Packard) trong chế độ đếm photon để đo phát xạ ánh sáng. Các phân tích phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được thực hiện sử dụng DNA từ sự chuyển gen và các cây đối chứng được chuẩn bị chủ yếu như mô tả (21). Cho sự lai DNA, bộ gen DNA được phân tích từ cây chủ yếu như báo cáo (21). Năm mươi μg DNA được cắt hạn chế với Hind II (Promega) và được tách ra trên gel agarose 0.8%. DNA được chuyển sang màng Duralon UV (Stratagene, LaJolla) cho sự lai với 700bp trong mảnh NPTIII như đầu dò (probe). Đầu dò được thiết kế để tìm ra trình tự bên để ước lượng số bản sao DNA.

 

Chúng tôi gửi lời cảm ơn đến C. Noriega và M. Sӧndahl cho sự cung cấp mô sẹo hoa hồng có khả năng phát sinh phôi và cho sự thảo luận của họ trong phương hướng của nghiên cứu này, J. Jones trong việc cung cấp plasmid, J.Matthew trong việc thực hiện Southerns, và A.Morgan cho những bình luận của bà trong bản thảo. Nghiên cứu này được tài trợ chủ yếu bằng Florigene BV, Thụy Sĩ.

 

1. Van der Krol, A., Lenting, P. E., Veenstra, J., van der Meer, I. M., Koes, R. E., Gerats, A. G. M., Mol, J. N. M. and Stuitje, A. R. 1988. An anti-sense chalcone synthase gene in transgenic plant inhibits flower pigmentation. Nature 333:866-869.

2. Smith, C. J. S., Watson, C. F., Ray, J., Bird, C. R., Morris, P. C., Schuch, W. and Grierson, D. 1988.  Antisense RNA inhibition of polygalacturonase gene expression in transgenic tomatoes. Nature 334:724-726.

3. Broglie, K., Chet, I., Holliday, M., Cressman, R., Biddla, P., Knowlton, S., Mauvais, C. J. and Broglie, R. 1991. Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani. Science 254: 1194-1197.

4. Robinson, K., and Firoozabady, E., 1993. Transformation of floricultural crops. Scientia Horticulturae 55: 83-99.

5. Broertjes, C. and van Harten, A. M., 1978. Roses, p. 178-185. In: Developmnets in crop science, (2). Elsevier, Amsterdam.

6. Noriega, C. and Sӧndahl, M. 1991 Somatic embryogenesis in hybrid tea roses. Bio/Technology 9:991-993.

7. De Wit, J. C., Esendam, H. F., Honkanen, J. J. and Touminen, U. 1990. Somatic embryogenesis and regeneration of flowering plants in rose. Plant cell Reports 9: 456-458.

8. Burger, D. W., Liu, L., Zary, K. W. and Lee, C. I. 1990. Organogenesis and plant regeneration from immature embryo of Rosa hybrida L. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 21: 147-152.

9. Ishioka, N. and Tanimoto, S. 1990. Plant reganeration from Bulgarian rose callus. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 22: 197-199.

10. Lloyd, D., Robert, A. V., and Short, K. C. 1988. The induction in vitro of adventitious shoots in Rosa. Euphytica 37:31-36

11. Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. J., and Shilperoort, R. A. 1983. A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303: 179-180.

12. Birot, A-M., Bouchez, D., Casse-Delbart, F., Durand-Tardif, M., Jouanin, L., Pautot, V., Robaglia, C., Tepfer, M., Tourneur, J. and Vilaine, F. 1987. Studies and use of the Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Plant Physiol. Biochem. 25:323-335.

13. Lemieux, C. S., Firoozabady, E. and Robinson K. E. P. R. 1990. Agrobacterium-mediated tranformation of chrysanthemum, p. 150-155. Proc. Eucarpia Symp. On Intergration of in vitro techniques in ornamental plant breeding. Jong. J. de (Ed,). (CPO Ctr. Pl. Breed. Res., Wageningen. The Netherlands.

14. Hood, E. E., Jen, G., Kayes, L., Kramer, J., Fraley, R. T. and Chilton, M. D. 1984. Restriction endonuclease map of pTiBo542, a potential Ti plasmi vector fos -genetic engineering of plant. Bio/Technology 2:702-709.

15. Jefferson, R. A, Kavanagh, T A. and Bevan, M W. 1987. GUS fusion: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6:3901-3907.

16. Lu, C-Y., Nugent G., Wardley-Richardson, T., Chandler, S. F. Young, R. and Dalling, M. J. 1991. Agrobacterium-mediated transformation of walnut somatic embryos and regeneration of transgenic plants. Bio/Technology 6:800-804.

17. McGranahan, G. H., Leslie, C. A., Uratsu, S. L., Martin, L. A. and Dandekar, A. M. 1988. Agrobacterium-mediated transformation of walnut somatic embryos and regeneration of transgenic plants. Bio/Technology 6:800-804.

18. Mathews, H., Litz, R.E., Wilde, D. E., Merkle, S. S, Wetzstein, H. Y. 1992. Stabe intergration and expression of -glucuronidase and NPTII genes in mango somatic embryos. In Vitro 28P:172-178.

19. D’Halluin, K., Bossut, M., Bonne, E., Mazur, B., Leemans, J. and Botterman, J. 1992. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants. Bio/Technology 10:309-314.

20. Firoozabady, E. and Galbraith, D. W. 1984. The effects of cell wall and cell cycle on crown gall tumorigenesis. HortScience 18:618.

21. Ausubel, F. M., Brent, R., Kington, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., and Struhl, K. 1992. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Media PA.

22. Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15:473-497.

23. Chu, C. C., and, J. J., and Sun, J. S. 1975. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiment of the nitrogen sources. Scientia Sinica 18:659-668.

24. Ow, D. W., Wang, K. V., DeLuca, M., de Wet, J. R., Helsinki, D. R. and Howell, S. H. 1986. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plnats. Science 234:856-859.

25. Ditta, G., Stanfeld, S., Corbin, D., and Helenski, D. R., 1980. Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: Construction of a gene bank of Rhizobium mwliloti. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 7:7347-7351.