Tóm tắt
 

Curculigo orchioides Gaertn là loài thảo dược có nguy cơ tuyệt chủng với tính kháng oxi hóa và kháng ung thư. Thân rễ và rễ củ của cây được sử dụng rộng rãi ở Ấn Độ như dược liệu địa phương. Vì có nhiều công dụng, nhu cầu của Curculigo orchioides tăng liên tục, tuy nhiên, nguồn cung cấp khá thất thường và không đủ. Tận thu, kết hợp với sự phá hủy môi trường sống dưới dạng phá rừng làm vấn đề thêm trầm trọng. Loài này hiện đang được coi là ‘có nguy cơ tuyệt chủng’ trong môi trường tự nhiên.

Vì vậy, nhu cầu bảo tồn của cây này là rất quan trọng. Ở đây chúng tôi mô tả một quy trình hiệu quả cho sự nảy mầm nhờ ‘đóng gói phôi trong alginate Na’ của Curculides orchioides. Hình thái mô sẹo (Morphogenic callus )  được tạo ra trên môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962) [16] (MS) chứa 0,5 - 3 mg/L 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) và 0,5 mg/L N6-benzylaminopurine (BAP) từ các thân củ.

Việc chuyển đổi calli phát sinh hình thái sang môi trường MS với 1-4 mg/L BAP dẫn đến sự hình thành sinh phôi ở tần số cao, trung bình 23 ± 0,8 phôi somatic trên mỗi gram mô sẹo phát sinh hình thái trên môi trường MS với BAP (1 mg/L). Hơn nữa, nảy mầm của ‘phôi somatic được đóng gói trong alginate natri’ của Curculigo orchioides đã được thử nghiệm trên môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1/2 MS) tăng cường với nước dừa (10% v/v).

Tần suất tái sinh từ phôi soma được đóng gói bị ảnh hưởng đáng kể do nồng độ sodium alginate và thời gian tiếp xúc với canxi clorua. Đóng gói phôi Somatic với alginat natri 2.5% hòa tan trong dung dịch muối cơ bản MS đã ghi nhận sự nảy mầm đáng kể so với các phương pháp khác. Một thời gian ngâm tương đối ngắn (5 phút) trong dung dịch canxi clorid giúp sự đóng gói đồng nhất của phôi soma, cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (80%). Hạt nhân tổng hợp tạo ra các cây con bình thường. Dựa trên các quan sát, một phương pháp cải tiến có thể được xây dựng để bảo tồn ex situ của các loài đang bị đe dọa - C. orchioides.

 

Giới thiệu:
 

Curculigo orchioides Gaertn.  (Hypoxidiaceae) được biết đến phổ biến là “musli đen” ở Ấn Độ. Thân rễ cũng như rễ củ của cây được sử dụng rộng rãi trong hệ thống của ngành dược ở Ấn Độ, Pakistan và Trung Quốc, để trị nhiều loại bệnh bao gồm vàng da, hen suyễn và thấp khớp (Dhar et al, 1968) [10]. Chiết xuất từ thân rễ được sử dụng như thuốc bổ để khắc phục liệt dương (Chopra et al, 1956) [8], để chống lại loãng xương (Cao et al, 2008) [6] cho tác dụng trị đái tháo đường (Madhavan et al, 2007), tác dụng kháng khuẩn (Nagesh and Shanthamma, 2009).

 

C. orchioidesis một loại thảo mộc nhỏ, lâu năm với thân rễ hình trụ dài. Loài này được tìm thấy ở độ cao 2300m so với mực nước biển đến đặc biệt là trên đất đá tổ ong ẩm. Các hoạt chất đã được báo cáo là có chứa flavones,

glycosides, steroid, saponin, triterpenoid (Misra và cộng sự, 1984; Misra và cộng sự 1990, Xu et al 1992) [14, 15, 24]. Thông thường cây trồng được nhân giống thông qua hạt và chỉ phát triển trong mùa mưa. Hạt giống và nảy mầm kém hạn chế sự nhân giống tự nhiên. Liên quan đến việc này, việc khai thác quá mức đã dẫn đến tình trạng đang bị đe dọa ở hiện tại của loài này (Ansari 1993, Anonymous 2000) [3, 2]. Nuôi tế bào thực vật như một công cụ có ích để bảo tồn và nhân giống nhanh các loài cây thuốc quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng [Sanyal et al. 1998] [18].

 

Sự phát sinh trực tiếp từ phôi soma và hình thành chồi trực tiếp từ nuôi cấy thân rễ và lá C. orchioides đã được báo cáo (Augustine và Souza, 1997, Suri, và các cộng sự 1999 [20], Thomas và Jacob, 2004, Nagesh, 2008; Nagesh et al. , 2008) [5, 21]. Tuy nhiên, không có báo cáo về sự hình thành phôi soma từ callus có nguồn gốc từ thân rễ.
 

Hơn nữa, sản xuất “hạt nhân tạo” là một trong những phương pháp nuôi cấy mô thực vật, nuôi cấy in vitro mang lại nhiều lợi ích về không gian, thời gian, lao động, chi phí tổng thể và bảo tồn các cây thuốc có nguy cơ tuyệt chủng. Một loạt các tác nhân hóa học như agar, agarose, alginate, carragenan, gelrite, polyacrylamide, nitrocellulose và ethylocellulase đã được thử nghiệm cho việc ‘đóng gói’. (Reden baugh và cộng sự, 1987). Phôi soma/mầm thực vật sử dụng một phương pháp đóng gói alginate đã được thực hiện ở các cây thuốc khác (Ara và cộng sự, 2000) [4], theo như hiểu biết của chúng ta, không có báo cáo về đóng gói phôi soma của Curculigo orchioids. Do đó, nghiên cứu này tìm ra việc đóng gói phôi soma và cũng báo cáo về các thông số tối ưu cho sự nảy mầm của phôi soma Curculio orchioides được đóng gói.
 

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
 

Vật liệu và sự khử trùng
 

Cây trưởng thành dài khoảng 12 cm được lấy suốt mùa mưa từ vùng đồi Biligiri  Rangana (độ cao khoảng 600-1300 m) (Karnataka). Thân củ (dài khoảng 10 cm) được thu lấy và rửa với chất tẩy rửa trung tính, teepol (10% v/v) trong 10 phút. Mẫu được khử trùng bề mặt với hỗn hợp của cetrimide (0.25% w/v) và ampicillin (0.15% w/v) trong 10 phút, tiếp theo khử trùng mẫu với thủy ngân chloride (0.1% /v). Các mẫu vô trùng được rửa với nước cất vô trùng để làm sạch chất khử trùng sau mỗi lần khử trùng. Thân củ được cắt mỏng với bề dày khoảng 1 cm để cấy lên môi trường.

Xác định tiềm năng của lát mỏng thân củ từ xa đến gần vùng ngọn trong việc hình thành callus
 

Trong thí nghiệm sơ bộ để xác định nguồn mẫu cấy tiềm năng, thân rễ được cắt lát thành mười lát dày 1 cm từ vùng gần ngọn đến vùng xa ngọn để kiểm nghiệm cho việc cảm ứng mô sẹo trên MS + 2,4-D (1mg/l). Từ lát thân rễ vùng gần chồi - proximal rhizome disc (PRD) cho nhiều mô sẹo hơn, các thí nghiệm trên thực hiện chỉ với PRD. 
 

Môi trường và điều kiện nuôi cấy
 

Môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962) [16] bao gồm chất khoáng và vitamin với 30 g/l sucrose và 0,8% agar. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật và sự kết hợp của chúng được bổ sung vào môi trường. Độ pH của môi trường đã được điều chỉnh xuống còn 5,8 trước khi hấp tiệt trùng ở 121°C, điều kiện nuôi cấy tại 24+2oC dưới đèn huỳnh quang và chiếu sáng 16h, ngoại trừ các mẫu cấy cho việc tạo sẹo thì được để ở 24+2°C trong bóng tối .
 

Ảnh hưởng của điều hòa sinh trưởng trong cảm ứng mô sẹo sinh phôi và phôi Soma từ lát cắt thân rễ được nuôi trên môi trường cơ bản MS với nồng độ khác nhau của 2,4-D (0,5 - 3 mg/l) hoặc NAA (0,5 - 3 mg/l) riêng lẻ và kết hợp với BAP (0,5 mg/l) hoặc Kn (0,5 mg/l) để khởi phát tạo mô sẹo.
 

Sự phát triển phôi soma và tái sinh cây
 

Nuôi cấy hình thái (morphogenic cultures) thu được từ môi trường MS chứa 2,4 -D được kết hợp với BAP hoặc Kn và 4 tuần sau chúng được cấy chuyền trên môi trường MS với BAP (0,5-4 mg/l) và cũng như Kn (0,5-4 mg / l) riêng lẻ để khởi phát tạo phôi soma. Kiểm soát nuôi cấy được  duy trì trên môi trường MS thiếu chất điều hòa sinh trưởng.
 

“Đóng gói” phôi soma
 

Trong thí nghiệm đầu tiên, natri alginate (W201502 – Sigma hoặc S1320- Duchefa) đã được thử nghiệm ở nồng độ 1,5%, 2,0% và 2,5% (w/v) trong dung dịch ½ MS. Phôi soma tách ra và phân tán trong dung dịch alginate natri được hút vào pipette đường kính 5-mm bên trong và thả khéo léo vào 100 ml dung dịch CaCl2 100 mM, như vậy nên mỗi giọt chứa duy nhất một phôi soma. Sau 5 phút, hạt này đã được lấy ra khỏi dung dịch, rửa sạch với môi trường MS cơ bản có bổ sung 3% (w/v) sucrose và đặt trên môi trường thạch có 0,7% agar chứa 3% sucrose, đặt dưới ánh sáng huỳnh quang trắng cho sự nảy mầm. Hạt được chuẩn bị trong 2,5% alginate như trên và sau đó để trong 100 mL dung dịch CaCl2 100 mM trong 5, 10, 15, 20 và 30 phút để đông cứng trước khi thu hồi và nuối cấy sau đó.
 

Phân tích thống kê số liệu 
 

Mỗi nghiệm thức bao gồm 50-60 mẫu hoặc mô sẹo, và mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần. Các dữ liệu cho thấy giá trị trung bình + S.E. của ba lần lặp lại hoặc nhiều hơn. ANOVA được thực hiện trên các kết quả của mỗi thí nghiệm và sau đó khẳng định tầm quan trọng của các giá trị F, dữ liệu có nghĩa được so sánh bằng phép thử Duncan’s multiple range (P <0,05).
 

Kết quả và thảo luận
 

Xác định tiềm năng của lát mỏng thân củ từ xa đến gần vùng ngọn trong việc hình thành callus

Đối với thí nghiệm ban đầu để kiểm tra phản ứng của các đoạn thân rễ trên môi trường cơ bản MS được bổ sung 2,4-D (1 mg/l) cho sự kích thích của callus, callus được gây ra từ phần gần hơn phần đầu xa đỉnh chồi (hình 1 và hình 2A). Do đó các thí nghiệm tiếp tục được thực hiện chỉ sử dụng các lát thân rễ gần chồi.
 

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đối với sự hình thành callus có khả năng sinh phôi sinh ra Và phôi somatic.
 

Sự phát triển của Callus đã được quan sát thấy từ tất cả các môi trường đã được kiểm tra trong vòng 1 tuần, ngoại trừ môi trường cơ bản vì các mẫu trở nên hoại tử hoặc cho thấy ít dấu hiệu tăng trưởng. Sự tăng sinh callus nhanh và callus phủ toàn bộ mẫu, 3 tuần sau khi nuôi cấy callus (inoculation). Tần suất của các mẫu phát sinh calli cao hơn ở môi trường với BAP 0,5 mg / l kết hợp với 2, 4-D (3 mg / l).
 

Hai loại callus có thể được nhận ra theo màu sắc và kết cấu. Loại I callus mềm và trắng, với bề mặt mịn màng,nhìn có vẻ  ướt và được cấu tạo chủ yếu là các tế bào dài, hình ống hoặc bất thường đã được bỏ, không có các nhân rõ ràng. Rõ ràng, những tế bào này không thể phát sinh phôi. Kiểu I callus được tạo ra trên môi trường MS bổ sung 2,4-D (0,5 -3 mg / l) hoặc NAA (0,5 -3 mg / l) một mình hoặc NAA kết hợp với cytokinin.
 

Mặt khác, môi trường có 0,5 mg / l BAP hoặc Kn (0,5 mg / l) kết hợp với 2,4-D (0,5-3 mg / l) thân rễ chuyển đổi thành callus loại II. Nó có màu vàng nhạt, có bề mặt không đều và bao gồm các tế bào nhỏ tạo thành các khối tròn nhỏ, các tế bào có chứa tinh bột, mô sẹo loại II có khả năng tạo phôi đã được xác minh bằng các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi nuôi cấy dưới ánh sáng, trên môi trường có chứa cytokinin riêng lẻ, loại II callus phát triển nhanh thành các nốt xanh lục.

Sự phát triển phôi soma
 

Mô sẹo sinh phôi (loại II), sau khi chuyển sang môi trường MS không có chất điều hòa tăng trưởng hoặc môi trường MS với 2,4-D hoặc NAA tại 0.1-0.5 mg/l, thì không tạo phôi somatic. Tuy nhiên, trên môi trường bổ sung với BA 0.5-4.0 mg/l đơn lẻ hoặc kết hợp với 2,4-D hoặc NAA ở 0,1-0,5 mg/l, các cấu trúc tròn trơn xuất hiện trên bề mặt callus sinh phôi trong vòng 1 tuần (Hình 2B). Giải phẫu mô học cho thấy các cấu trúc này là phôi somatic ở giai đoạn hình cầu, không có kết nối mạch với mô sẹo (Hình 2C). Phôi cầu phát triển hơn nữa thành phôi tim và phôi hình ngư lôi sau 2 tuần và phôi soma ở giai đoạn sơ khởi được quan sát thấy sau 4 tuần. Tần số cao xuất hiện trên môi trường MS có chứa 0,1 mg/l BAP ở nồng độ 1mg/l (Hình 2) trung bình 23 ± 0,8 tế bào phôi somatic thu được từ 1g callus có khả năng sinh phôi (Hình 3). Nuôi cấy kéo dài không kích thích tăng số phôi sơ khởi. Mặc dù một số phôi vẫn nảy mầm, quá trình phát triển khá chậm. Đôi khi phôi somatic thứ phát được quan sát trên bề mặt phôi nảy mầm. Vào một thời điểm nhất định, các phôi somatic ở các giai đoạn phát triển khác nhau được tìm thấy trên cùng một callus, cho thấy sinh phôi soma ở callus C. cultioides không đồng bộ.
 

Nhiều yếu tố bao gồm sự điều chỉnh của các chất điều hòa tăng trưởng và sự lựa chọn mẫu có liên hệ với sự thành công trong hình thành phôi soma. Mặc dù sự phát sinh phôi soma đã được quan sát thấy ở nhiều cây trồng từ các nhà khoa học khác nhau (Williams và Maheswaran, 1986) [23], sự lựa chọn mẫu là rất quan trọng để tạo ra callus có khả năng phát sinh phôi ở C.parioides. của tất cả các phần trên thân củ, chỉ những phân đoạn gần ngọn sản sinh callus trên các môi trường được sử dụng, hỗ trợ để kết luận rằng trạng thái bên trong của các tế bào phát triển là điều quan trọng hàng đầu trong việc biểu hiện, với các điều kiện khác như các chất điều hòa tăng trưởng ngoại sinh chỉ đơn giản là 'cho phép' biểu hiện sự phát triển được xác định bên trong (Zimmerman, 1993) [25].
 

Sự hình thành của callus có khả năng sinh phôi thường được hỗ trợ bởi nồng độ cao các auxins, đặc biệt là 2,4-D (Tiwari, 1998, Zhang, và các tác giả, 2008) [6, 19, 22] và có gợi ý về sự hình thành các tế bào phôi có liên quan đến methyl hóa DNA nhân với sự hiện diện của mức độ cao 2,4-D (Loschiavo và cộng sự, 1989) [12]. Trái ngược với C.parioides, 2,4-D kết hợp với mức BAP thấp là cần thiết để tăng khả năng sinh callus có khả năng sinh phôi, như báo cáo trong Brahmi (Tiwari và cộng sự, 1998) [19, 22]. Nhiều báo cáo chỉ ra rằng sự phát triển của “phôi” thường liên quan đến việc giảm hoặc bỏ qua auxin từ môi trường (Carman, 1990, Ammirato, 1987) [1, 7]. Sự hình thành phôi soma ở mô sẹo C.accarioides đòi hỏi bổ sung cytokinin. Các nhu cầu tương tự đã được chứng minh là rất quan trọng đối với sự phát triển của phôi trong củ cải đường (Zhang và cộng sự, 2008) [6].
 

Mặc dù hầu hết các phôi somatic của C.quangloid phát triển bình thường, các dị thường khác nhau đã được quan sát thấy ở các nuôi cấy phôi. Sự phát triển của phôi bất thường cũng như sự hình thành sinh phôi soma được báo cáo [Ammirato, 1987] [1] và nguyên nhân chưa được biết đến rõ ràng. Người ta cho rằng hiện tượng này là do sự phát triển dẻo ( the developmental plasticity) của phôi soma vốn chịu ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy (Carman, 1990, Ammirato, 1987) [1, 7].

Đóng gói phôi soma
 

Các phôi nang somatic đóng gói với 2,5% algenite natri  cho thấy tần suất nảy mầm cao (80%). Sau 20 ngày cấy, các phôi nang đóng gói cho thấy sự phát triển sau 45 ngày, rễ và chồi đã được ép qua gel và kéo dài để tạo thành một cây phát triển tốt. (Hình 3). Các hạt có kích thước và hình dạng đồng đều thu được khi dung aginate natri 2,5%, nhưng ở nồng độ thấp hơn (1,5-2,0%), hạt không đều, không hình thành, làm giảm tần suất nảy mầm (Bảng 1). Redenbaugh et al. (1999) lưu ý rằng các điều kiện liên quan đến phương pháp đóng gói, bao gồm cả loại alginate và nồng độ, môi trường và các phương pháp được sử dụng để sản xuất hạt nhân tạo, chịu trách nhiệm về sự khác biệt đáng kể tỷ lệ chuyển đổi trong cỏ linh lăng, cà rốt và cần tây. Trong nghiên cứu này, nồng độ alginate natri thấp hơn (1,5-2,0%) sử dụng môi trường ½ MS làm dung môi cho thấy tần suất nảy mầm giảm. Điều này có thể là do sự độc tính của CaCl2 và sự giảm sức đề kháng của các hạt hình thành từ nồng độ alginate natri thấp. Hạt kháng thấp (Low  resistance  beads) tiếp xúc CaCl2 với thời gian dài hơn (5 phút) có thể hấp thụ lượng CaCl2 lớn hơn là một hiện tượng bề mặt và do đó CaCl2 có thể ức chế sự nảy mầm. Ngược lại, hạt có tính kháng cao hơn hình thành do sự gia tăng nồng độ alginat natri (2,5%) hấp thụ ít CaCl2 hơn. Do đó tính độc hại do CaCl2 có thể ít hơn trong giai đoạn sau và cho tần số nảy mầm cao hơn.

Thời gian tiếp xúc của CaCl2 trong quá trình làm cứng ảnh hưởng đáng kể, tần số nảy mầm nảy mầm của chồi đóng gói (Bảng 2). Tỉ lệ nảy mầm cao nhất (80%) được thu được khi hạt tráng alginat natri 2.5% hoà tan trong môi trường ½ MS, được ngâm trong dung môi để làm cứng chỉ trong 5 phút trong 100 mM CaCl2. Mặc dù hạt được hình thành sau 5 phút là rắn và chắc chắn để tạo thuận lợi cho việc gắp bằng kẹp, các chồi dài vẫn có thể nổi lên dễ dàng từ chúng khi nảy mầm. Nhưng sau 30 phút tiếp xúc với CaCl2 100 mM, một hạt rất cứng đã được hình thành và phần trăm nảy mầm thấp hơn.
 

Sau 6 tuần nuôi cấy phôi đóng gói được đặt trên môi trường MS cơ bản cho sự nảy mầm của chúng. Cây con thu được ở 65% trên các môi trường với phủ phôi 2% và phôi kiểm soát cho thấy 90% nảy mầm. Các phôi soma nảy mầm sau một tuần và nổi ra khỏi hạt đã được nhận thấy. Tuy nhiên, sự phát triển chồi bị trì hoãn trong 6 đến 8 ngày sau khi xuất hiện.

Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ và thành thần khác nhau của chất điều hòa tăng trưởng trong quá trình phát sinh hình thái callus từ mẫu thân rễ gần chồi của Curculigo orchioides

MS + chất điều hòa tăng trưởng		Khối lượng tươi (mg±SE)	Kiểu phản ứng
Đối chứng 2,4 D	-	400.24±0.00	Loại I callus không phát sinh cơ quan
	0.5	600.01±0.16
	1	1058.00±0.13
	2	2400.00±0.14
	3	2100.00±0.51
2,4 D + BAP	0.5+0.5	1120.70±0.17	Loại II callus có khả năng sinh phôi
	1+0.5	2188.00±0.00
	2+0.5	3504.10±0.78
	3+0.5	4103.20±0.12
2,4 D + Kn	0.5+0.5	800.85±0.19	Loại II callus có khả năng sinh phôi
	1+0.5	1502.25±0.20
	2+0.5	2109.80±0.78
	3+0.5	3001.00±0.01
NAA	0.5	150.00±0.13	Loại I callus không phát sinh cơ quan, với hoots
	1	500.08±0.11
	2	655.50±0.12
	3	550.00±0.08
NAA+BAP	0.5+0.5	501.35±0.48	Loại I callus thủy tinh thể với rễ tơ
	1+0.5	802.05±0.13
	2+0.5	887.00±0.29
	3+0.5	721.40±0.68
NAA+Kn	0.5+0.5	401.40±0.15	Loại I callus thủy tinh thể
	1+0.5	600.85±0.20
	2+0.5	622.80±0.20
	3+0.5	713.20±0.015

Số liệu gồm giá trị có nghĩa độ lệch chuẩn (n=25)

Loại I : mềm, trắng, trông có vẻ ướt và callus không phát sinh hình thái

Loại II: nốt, màu vàng, callus phát sinh phôi sần sùi

 

Đưa ra ngoài vườn
 

Phôi phát triển thành cây con 2 đến 4 cm với lá khỏe mạnh và rửa sạch để loại bỏ thạch dư từ rễ, khi cho vào chậu nhựa có chứa vermiculate, cát và đất (1: 1: 1) được khử trùng, tỷ lệ sống là 80%.
 

Một khía cạnh quan trọng của việc nhân giống trong ống nghiệm là tái sinh các cây có khả năng sống sót sau khi ra khỏi điều kiện vô trùng vốn được bảo vệ trong môi trường in vitro. Một số lượng đáng kể cây trồng vi nhân giống không tồn tại được khi chuyển từ điều kiện in vitro sang môi trường nhà kính hoặc ngoài đồng. Nhà kính và cánh đồng có độ ẩm tương đối thấp hơn đáng kể, môi trường tự hoại nghiêm trọng hơn, gây ảnh hưởng cho cây trồng vi nhân giống so với điều kiện in vitro. Tuy nhiên, lợi ích của bất kỳ hệ thống vi nhân giống  nào chỉ có thể được thực hiện đầy đủ bao gồm sự chuyển đổi thành công cây con từ các môi trường nuôi cấy mô đến các điều kiện môi trường ex vitro( ngoài ống nghiệm) (Hazarika, 2003) [11]. Trong nghiên cứu này, cây con được chuyển sang các chén nhựa có chứa môi trường để cứng. Dữ liệu ở đây rất hữu ích trong việc thiết lập các cải tiến để nhân rộng quần thể thực vật đang bị đe dọa.
 

Như vậy, thông tin hiện nay xác định rõ ràng sự tồn tại mối quan hệ chặt chẽ giữa mức độ và sự lựa chọn của cytokinin đối với sự kích thích sự hình thành phôi và sự phát sinh phôi somatic. Quy trình này có thể được sử dụng để sản xuất cây chuyển gien để cải tiến loài và bảo tồn nguồn gen cây ngoại lai của cây thuốc có tính kinh tế nhưng nguy cơ tuyệt chủng cao thông qua kỹ thuật đóng gói. Dữ liệu hữu ích trong việc thiết lập các cải tiến để nhân rộng và bảo tồn loài thực vật nguy cấp này.
 

Tài liệu tham khảo:
 

1.  Ammirato  PV.  Organizational  events  during  somatic embryogenesis.  In:  C.E.Green,  D.A.  Somers,  W.P. Hackett,  D.D.  Biesboer  (eds.),  Plant  Tissue  and  Cell Culture, Alan R. Liss, New York, 1987, 57-81. 

2.  Anonymous.  In  Plant  tissue  from  Research  to commercialization:  Decade  of  support.  (ed),  DBT Ministry of Science and Technology, India, 2000, 33-34. 

3.  Ansari  A.  Threatened  medicinal  plants  from  Madhaulia forest of Gorakhpur. J Econ Taxon Bot. 1993; 17:23-24. 

4.  Ara H, Jaiswal U, Jaiswal VS. Synthetic seed: Prospects and limitations. Curr Sci. 2000; 78(12):1438-1444 

5.  Augustine AC, D’Souza L. Regeneration of an anticancer herb Curculigo orchioides Gaertn. In vitro cellular  and Development biology– Planta 1997; 33:111-113. 

6.  Cao DP, Zheng YN, Quin LP, Han T, Zhang H, Rahman K et al.  Curculigo orchioides,  a  traditional  Chinese medicinal  plant,  prevents  bone  loss  in  ovariectomized 

rats. Maturitas 2008; 59(4):373-80. 

7.  Carman  JG.  Embryogenic  cells  in  plant  tissue  cultures: occurrence  and  behavior, In Vitro Cell  Dev  Biol  1990; 26:746-753. 

8.  Chopra RN, Nayarand SL, Chopra IC. Glossary of Indian medicinal plants. (CSIR) New Delhi India, 1956, 84. 

9.  Chun-Lai Zhang,  Dong-Fang Chen,  Marie Kubalakova, Jian Zhang,  Nigel W. Scott,  Malcolm C,  Elliott,  Slater  A Efficient  somatic  embryogenesis  in  sugar  beet  (Beta vulgaris L.) breeding line. Plant cell Tissue and organ cult 2008; 93(2):209-221. 

10. Dhar ML, Dhar MN, Dhawan BN, Mehrota DN, Ray C. Screening  of  Indian  plants  for  biological  activity  part-I. Indian J Expt Biol. 1968; 6:232-249. 

11. Hazarika BN.  Acclimatization  of  tissue-cultured  plants. Curr Sci 2003; 85:1704-1712. 

12. Loschiavo F, Pitto L, Giuliano G, Torti G, Notironchi V, Marazziti  D et al.  DNA  methylation  of  embryogenic carrot  cell  cultures  and  its  variations  as  caused  by mutation, differentiation, hormones and hypomethylating drugs. Theor Appl Genet 1989; 77:325-331. 

13. Madhavan V,  Joshi  R, Murali  A,  Yoganarasimhan  SN. Antidiabetic  Activity  of Curculigo OrchioidesRoot Tuber. Pharmaceutical Biology 2007; 45:18-21. 

14. Misra  TN,  Singh  RS,  Tripathi,  Sharma  SC.  Curculigo  a cycloartane, triterpene alcohol from Curculigo orchioide. Phytochem 1990; 29:929-931. 

15. Misra  TN,  Singh  RS,  Upadhya  J,  Tripathi  DNM. Aliphatic  compounds  from  Curculigo orchioides. Phytochem 1984; 23:1643-1645. 

16. Murashige  T,  Skoog  F.  A  revised  medium  for  rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol Plant 1962; 15:473-497. 

17. Rajesh  Singh,  Gupta  AK.  Antimicrobial  and  antitumor activity  of  the  fractionated  extracts  of  Kalimusli (Curculigo orchioides) International  of  Green  Pharmacy 2008; 2(1):34-36. 

18. Sanyal  M,  Dutta,  Gupta  S,  Jana  MK,  Kunolu  SC  Shoot organogenesis  and  plantlet  regeneration  from  leaf  callus cultures of tuberose (Polianthes tubesosa L.) Plant tissue Cult. Biotech 1998; 4:81-86. 

19. Shrivastava TL, Tiwari KP, Rubysharma Medicinal plants of  Madhya  Pradesh:  immediate  need  of  conservation.  J Tropical Forestry. 1998; 15:144-151. 

20. Suri  SS,  Sunithajain,  Ramawat  KG.  Plant  regeneration and bulbils formation in vitrofrom leaf and stem explants of Curculigo orchioides-an  endangered  medicinal  plant. Sci Horticultureae 1999; 79:127-134. 

21. Thomas TD, Jacob A. Direct Somatic Embryogenesis of Curculigo orchioides Gaertn,  an  Endangered  Medicinal Herb. J of Plant Biotechnology. 2004; 6(3):193-198. 

22. Tiwari  Deosingh,  Nath  B.  Shoot  regeneration  somatic embryogenesis  from  different  explants  of  Brahmi (Bacopa monnieri(L.) Pennell). Plant Cell Reports 1998; 17:538-543. 

23. Williams  EG,  Maheswaran  G.  Somatic  embryogenesis; factors  influencing  coordinated  behavior  of  cells  as  an embryogenic group. Ann Bot 1986; 57:443-462. 

24. Xu JP, Xu RS, Yuli X. Glycosides of cycloartane sapogenine from Curculigo orchioides. Phytochem 1992; 31:233-236. 

25. Zimmerman JI. Somatic embryogenesis: a model for early development  in  higher  plants.  Plant  Cell  Report  1993; 5:1411-1423.