Vanilla planifolia Andr. được biết đến là một loại cây hương liệu thương mại vùng nhiệt đới nổi tiếng với hương liệu phổ biến là vanillin. Vanillin là loại hương liệu đắt giá thứ hai thế giới, bên cạnh nghệ tây. Ethiopia có môi trường thuận lợi cho sản xuất vanillin và cây trồng có thị trường rộng lớn ở trong nước và quốc tế. Nhiều nhà đầu tư quan tâm đến việc sản xuất vanillin ở đất nước cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào và đáng tin cậy. Phù hợp với điều này, chúng tôi báo cáo quy trình nhân giống số lượng lớn bằng nuôi cấy mô tế bào có hiệu quả và có khả năng lặp lại cho các dòng vô tính ưu việt vanilla được đưa vào trong nước. Sự khác biệt đáng kể (p < 0.0001) được quan sát trong các kết hợp hoocmon đã chọn để gia tăng sự nhân chồi. Số lượng chồi trung bình 3.12 đến 4.17 thu được sau 45 ngày nuôi cấy mẫu cấy đốt thân trên môi trường MS được bổ sung BA kết hợp với KIN và NAA. Nồng độ tối ưu được tìm thấy là 1 mg/L BAP kết hợp với 1.5 mg/L KIN. Cả hai loại môi trường MS không có hoocmon và môi trường MS có bổ sung các mức NAA khác nhau đã ra rễ 100% ở các chồi được tách ra và chuyển lên môi trường ra rễ. Hơn 85% tỷ lệ sống sót đã đạt được trong quá trình thích nghi khí hậu. Với quy trình có sẳn này là một bước quan trọng hướng tới việc sản xuất vanilla quy mô lớn ở Ethiopia.

Vanilla planifolia Andr. là loại cây trồng hương liệu nhiệt đới quan trọng, được trồng thương mại để thu hoạch quả đậu. Các quả đậu của vanilla là nguồn gốc của loại hương liệu phổ biến gọi là vanillin. Vanillin chủ yếu được sử dụng trong bánh ngọt, kem, kẹo, sô cô la và đồ uống. Nó cũng được sử dụng trong ngành mỹ phẩm và nước hoa (Goodenough, 1982). Đây là loại hương liệu đắt thứ hai trên thị trường thế giới, bên cạnh nghệ tây (Ranadive, 1994). Sản lượng vanilla của thế giới ước tính đạt khoảng 3500 tấn/năm và gần 300 tấn được tiêu thụ tại Mỹ. Nước Cộng hòa Malagasy trồng khoảng 70 đến 80% sản lượng cây vanilla thế giới (Geetha và Shetry, 2000)
 

Trong một nỗ lực nhằm thay đổi hình ảnh đất nước tâm tối trong mắt thế giới, Ethiopia đang thực hiện chính sách công nghiệp hóa để phát triển nông nghiệp. Giống như các nước đang phát triển khác, nơi mà nguồn vốn đang còn hạn chế trong khi lao động và đất đai thì phong phú, lợi thế cạnh tranh của chúng tôi trên thị trường thế giới là cung cấp các sản phẩm nông nghiệp đạt tiêu chuẩn. Phù hợp với điều này, điều kiện môi trường thuận lợi sẵn có (Ranadive, 1994) và tiềm năng thị trường địa phương và quốc tế khổng lồ đã thúc đẩy sản lượng lớn vanilla ở Ethiopia lâu nay. Do đó, các nhà đầu tư bắt đầu gõ cửa của JARC, trung tâm kiểm soát nghiên cứu cà phê và gia vị quốc gia, để cung cấp vật liệu cây trồng vanilla. Tuy nhiên, vấn đề chính là làm thế nào để sản xuất đủ vật liệu cây trồng vượt ngoài số lượng cây có sẵn trong nước để có thể đáp ứng nhu cầu khổng lồ này.
 

Vanilla là một loài lan thân leo, thường được nhân giống bằng cách giâm cành cây trưởng thành. Tuy nhiên, phương pháp này chậm, sử dụng nhiều lao động và tốn thời gian. Nó cũng không kinh tế khi việc thu hoạch cành để nhân giống làm kiềm hãm sự tăng trưởng và phát triển của cây mẹ (Geetha và Sheety, 2000, Giridhar và cộng sự, 2001). Hơn nữa, nhu cầu thị trường hầu như không thể đáp ứng được bằng cách giâm cành từ những cây có sẵn trong nước. Do đó, bắt buộc phải khai thác tiềm năng của nuôi cấy mô để nhân giống hiệu quả và cung cấp số lượng lớn nhu cầu vật liệu để đáp ứng cho việc trồng với quy mô lớn.
 

Bằng cách sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô, vanilla được nhân giống ở cả hai hình thức cơ quan hóa trực tiếp (Philip và Nainar, 1986) và cơ quan hóa gián tiếp (Davidonis và Knorr, 1991; Gu và cộng sự, 1987). Các nguồn mẫu cấy khác nhau đã được sử dụng cho việc nhân giống in vitro của vanilla thông qua quá trình cơ quan hóa trực tiếp. Geetha và Sheety (2000) và Kononowicz và Janick (1984) báo cáo về hiệu quả của việc sử dụng đỉnh chồi và các đoạn đốt thân cho các quá trình vi nhân giống, trong khi George và Ravishanker (1997) sử dụng chồi nách để nhân giống in vitro vanilla. Trong hầu hết các trường hợp, sự tăng sinh của chồi đạt được do sự tăng trưởng của chồi nách hoặc sự hình thành protocorm. Tuy nhiên, việc nhân giống với quy mô thương mại lớn đòi hỏi quy trình đơn giản, kinh tế, tỷ lệ nhân giống cao và khả năng lặp lại cao mà không có sự can thiệp của giai đoạn mô sẹo hoặc protocorm để cung cấp cho dòng vô tính đồng nhất. Ở đây, chúng tôi báo cáo hiệu quả của quá trình nhân giống in vitro các dòng vô tính vanilla được tìm thấy ở Ethiopia bằng cách sử dụng nguồn mẫu cấy là những đoạn đốt thân.
 

Quá trình tái tạo và nhân giống tiến hành trong thí nghiệm được tóm tắt trong Hình 1. Các mẫu đốt thân được thu thập từ cây vanilla trồng trong vườn ươm (Hình 2a) được rửa nhẹ bằng chất tẩy lỏng sau đó rửa lại dưới vòi nước máy trong 30 phút. Các mẫu cấy được cắt tỉa để chỉ còn hai đốt thân ở cả hai bên trên một lóng thân và được ngâm trong dung dịch "Kocide" 3g/L trong 30 phút. Sau đó, rửa mẫu cấy 3 - 5 lần trong nước cất, tiếp theo các đốt thân được nhúng trong cồn 70% trong 5 phút đặt trong tủ an toàn sinh học. Sau đó các đốt thân này được rửa sạch với nước cất 3 - 5 lần và chuyển vào bình vô trùng có dung dịch HgCl2 0.1% trong 5 phút đồng thời lắc nhẹ. Các mẫu cấy sau đó được rửa lại với nước cất vô trùng 3 - 5 lần để rửa sạch hoàn toàn HgCl2.
 

Các đoạn đốt thân tiệt trùng được đặt lên những đĩa petri tiệt trùng để loại bỏ phần bị tẩy trắng ở cả hai đầu. Sau đó các mẫu cấy được đưa vào trong môi trường điều hòa và duy trì để nuôi cấy trong ba ngày. Sau 3 ngày, các mẫu cấy sạch được đưa vào môi trường khởi đầu để làm tăng số lượng đốt thân cho quá trình nhân giống. Môi trường nuôi cấy khởi đầu chứa môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung với sucrose 30 g/L, agar 8 g/L, BAP 1 mg/L và GA3 0.5 mg/L. Sau 45 ngày thu được các chồi dài với 6 - 8 đốt thân, tiến hành cắt thành các đoạn ngắn với mỗi hai đốt thân. Các đốt thân được nuôi cấy trên môi trường nhân chồi trong khi tiếp xúc với môi trường ở vị trí nghiêng để khuyến khích sự nảy mầm của nhiều chồi xung quanh đốt. Môi trường nhân chồi là môi trường MS được bổ sung sucrose 30 g/L và agar 8 g/L, các mức BAP khác nhau (0, 1, 2 và 3 mg/L) kết hợp với NAA (0.0, 0.5, 0.75, 1.0 và 1.25 mg/L) hoặc Kin (0.0, 0.5, 1.0 và 1.5 mg/L). Các chồi nhân được tách ra và chuyển vào môi trường mới sau mỗi 45 ngày để nuôi cấy thứ cấp từ 4-5 lần. Các chồi nhân cuối cùng đã được chuyển vào môi trường MS không chứa hoocmon để ra rễ và kéo dài trong một tháng trước khi chúng được đưa ra vườn ươm để thích nghi với môi trường. Các cây non đượuc đặt trong ống nhựa polyethylene để giúp cây phát triển cứng cáp và được tưới phun hàng ngày để duy trì độ ẩm tương đối (RH) ở mức cao tương tự như độ ẩm trong bình nuôi cấy. RH giảm dần từ 100% xuống còn 60% trong vòng hai tuần. RH tiếp tục giảm đến độ ẩm bình thường của môi trường trong hai tuần tiếp theo. Đồng thời, cường độ ánh sáng tăng lên dần từ 30% khi bắt đầu quá trình cứng cây đến đến khi cường độ ánh sáng đạt đầy đủ. Trong quá trình này đã có hơn 85% tỷ lệ sống sót và sau đó các cây con đã được trồng vào các chậu thông thường trong vườn ươm.
 

Trong số 90% mẫu cấy không nhiễm bẩn thu được 60% mẫu cấy tồn tại trong áp suất khử trùng khi áp dụng kỹ thuật khử trùng nêu trên. Môi trường điều hòa và môi trường khởi đầu được chuẩn bị trong các ống nghiệm để chuyển các mẫu cấy sạch vào nuôi cấy (Hình 2b). Bốn đoạn đốt thân được nuôi cấy trong mỗi bình môi trường khởi đầu. Sau 45 ngày, từ hai đốt thân đã tạo ra 6 - 8 đốt thân. Sự bổ sung GA3 tạo điều kiện cho đốt thân phát triển thẳng đứng và kéo dài lóng thân.
 

Phản ứng biệt hóa đạt được bằng cách sử dụng BAP ở các mức nồng độ khác nhau kết hợp với Kin hoặc NAA. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.0001) giữa các nghiệm thức đối với quá trình khởi đầu nhân chồi từ mỗi mẫu cấy. Sau khi nuôi cấy thứ cấp lần đầu tiên, 45 ngày, số lượng chồi trung bình 3.42 đến 4.17 có thể dễ dàng phân tách và nuôi cấy trên môi trường mới (Hình 2c) với sự kết hợp các hoocmon được đề cập ở trên (Bảng 1). Tuy nhiên, các chồi nhân phát triển rõ ràng và đầy đủ được quan sát thấy chủ yếu khi chỉ sử dụng một mình BAP 1 mg/L \ (Hình 2d). Không có sự khác biệt đáng kể đối với việc kích thích nhân chồi giữa môi trường không có hoocmon và môi trường bổ sung 2 hoặc 3 mg/L BAP kết hợp với các mức nồng độ NAA khác nhau (0.5; 0.75; 1.0 và 1.5 mg/L). Điều này cho thấy xu hướng hình thành nhiều chồi nhân nhỏ trong giai đoạn đầu phát triển mô sẹo qua thời gian, đặc biệt là sau khi nuôi cấy thứ cấp đầu tiên khi mức BAP và Kin cao. Kết quả này đồng thời với các kết quả thu được từ Geeth và Sheety (2000), George và Ravinshaker (1997) và Kalimuthu và cộng sự (2006) của sự kích thích nhân chồi bằng cách kết hợp BAP với Kin và NAA.
 

Số lượng chồi nhân thu được sau khi nuôi cấy thức cấp lần hai cho thấy sự khác biệt đáng kể (p < 0.0006) và số lượng chồi trung bình tăng tối thiểu 1 đến 1.33 và tối đa là 4.17 đến 5 (Hình 2e). Số lượng chồi tối đa trên mỗi đốt được ghi nhận trong suốt toàn bộ thí nghiệm là 12, trong khi tối thiểu là 1. Việc phân tách các chồi nhân sau mỗi lần nuôi cấy thứ cấp và nuôi cấy chúng trên môi trường nhân chồi mới cho kết quả số lượng chồi trung bình tăng gấp ba lần so với nuôi cấy thứ cấp trên môi trường nhân chồi mới nhưng không tách các chồi riêng lẻ (Hình 2f và g). Ngoài các môi trường bổ sung với 2 mg/L BAP, nơi các mô sẹo được phát hiện, sáu sự kết hợp hoocmon hàng đầu vẫn không thay đổi.
 

1. Rửa đoạn đốt thân bằng dung dịch tẩy rửa và rửa với vòi nước máy 30 phút

 

2. Giảm kích thước của những đoạn đốt thân chỉ còn 2 đốt thân ở hai bên trên mỗi lóng

 

3. Ngâm trong dung dịch "Kocide" 3g/L trong 30 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất

 

4. Nhúng đốt thân vào trong cồn 70% trong 5 phút

 

5. Các đốt thân được khử trùng trong dung dịch HgCl2 0.1% trong 5 phút, lắc nhẹ, sau đó được rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần.

 

6. Nuôi cấy trong môi trường điều hòa trong 3 ngày

 

7. Môi trường nuôi cấy khởi đầu

 

8. Môi trường nhân chồi (1)

 

9. Môi trường nhân chồi (2)

 

10. Môi trường nhân chồi (3)

 

11. Môi trường nhân chồi (4)

 

12. Môi trường ra rễ và kéo dài

 

13. Thích nghi khi hậu

 

14. Trồng ra chậu
 

Hình 1. Sơ đồ mô tả quá trình nhân giống vanilla

Hình 2. (A) Cây vanilla trong vườn ươm được sử dụng làm nguồn nốt thân. (B) Đốt thân được nuôi cấy trên môi trường nhân chồi. (C) Chồi nhân sau 45 ngày. (D) Chồi nhân sau 60 ngày. (E) Chồi nhân sau nuôi cấy thứ cấp lần 2. (F và G) Quá trình nhân chồi diễn ra tiếp tục. (H) Ra rễ (I) Cây non được đưa ra hỗn hợp đất để thích nghi với khí hậu. (J) Cây non thích nghi khí hậu trong hai tuần. (K) Cây non đã sẵn sàng để trồng ra chậu. (L) Cây con đã được trồng ra chậu.
 

 

Bảng 1. Số lượng trung bình số chồi được sản xuất cho mỗi thí nghiệm

Có sự khác biệt đáng kể giữa nghiệm thức (p <0.0001). Môi trường nuôi cấy bổ sung BA (1) + Kin (1,5), BA (0) + Kin (1), BA (3) + Kin (1), BA (1) + NAA (0,75), BA (2) + Kin 0) và BA (1) + NAA (0) là sáu sự kết hợp hoocmon hàng đầu trong môi trường. Các môi trường nuôi cấy được bổ sung bằng BA (0) + NAA (1), BA (0) + NAA (0) và BA (0) + NAA (0.5) là ba phương tiện kết hợp dưới cùng.

 

 

 

Bảng 2. Số lượng đốt thân hình thành và ra rễ.

 

Không có sự khác biệt đáng kể được phát hiện giữa môi trường không có hoocmon và môi trường có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau (0.5; 0.75; 1.0 và 1.5 mg/L) đối với sự ra rễ (p < 0.431) và kéo dài (p < 0.0843). Số lượng đốt thân trung bình tối đa được ghi nhận sau 1 tháng là 4.11 đối với môi trường MS được bổ sung 1.25 mg/L NAA trong khi tối thiểu là 2.83 đối với môi trường MS được bổ sung 1 mg/L NAA (Bảng 2). Sự khác biệt không đáng kể đã được quan sát thấy giữa môi trường MS không chứa hoocmon và môi trường bên trên cho sự kéo dài. Trong bốn môi trường kết hợp, 100% rễ hình thành đã được ghi nhận đối với môi trường MS không chứa hoocmon (Hình 2h). Điều này phù hợp với các phát hiện của George và Ravishanker (1997) và Philip và Nainar (1986). Hơn 85% tỷ lệ sống sót được ghi nhận trong quá trình thích nghi với khí hậu (Hình 2i, j và k).
 

Kết luận, hiệu quả của báo cáo đầu tiên về sự nhân giống vanilla đã được so sánh với các báo cáo sẵn có cho đến nay (Geeth và Sheety, 2000) và có thể được sử dụng để cung cấp nguyên liệu trồng cây quy mô lớn. Quy trình này cũng có thể được sử dụng để bảo tồn một vài giống v. Planifolia được đưa vào trong nước.
 

 

Các tác giả của bài báo này xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự đóng góp không hạn chế của tất cả các thành viên phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thuộc Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Jimma. Đặc biệt đáng chú ý là đóng góp của bà Roman Getachew và ông Abate Guangul.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

Davidonis G, Knorr D (1991). Callus formation and shoot regeneration in vanilla planifolia. Food Biotechnol. 5: 59-66. 

Geetha S, Shetty SA (2000). In vitro propagation of Vanilla planifolia, a tropical orchid. Curr. Sci. 79(6): 886- 889 

George PS, Ravishankar GA (1997). In vitro multiplication of Vanilla planifolia using axillary bud explants. Plant Cell Rep. 16: 490-494. 

Giridhar P, Reddy BO, Ravishankar GA (2001). Silver nitrate Influences invitro shoot multiplication and root formation in Vanilla planifolia Andr. Curr. Sci. 81(9): 1166-1170.

Goodenough DR (1982). Vanilla, vanillin and vanillin derivatives. Bakers Dig. 56: 8-10. 

Gu Z, Arditti J, Nyman LP (1987). Vanilla planifolia: Callus induction and plantlet production in vitro. Lindleyana, 2: 48-52. 

Kalimuthu K, Senthilkumar R, Murugalatha N (2006). Regeneration and mass multiplication of Vanilla planifolia Andr: a tropical orchid. Curr. Sci. 91(10): 1401-1403. 

Abebe et al. 6821 Kononowicz H, Janick J (1984). In vitro propagation of Vanilla planifolia. Hort. Sci. 19: 58-59. 

Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol. 15: 473-497. 

Philip VJ, Nainar SAZ (1986). Clonal propagation of vanilla planifolia (Salisb) Ames using tissue culture. J. Plant Physiol. 122: 211-215. 

Ranadive AS (1994). Vanilla-Cultivation, curing, Chemistry, Technology and Commercial products: In Spices, Herbs and Edible Fungi by George. C. (ed). ELSEVIER, New York, Tokyo. pp. 517-604.

Minh Hiếu
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com