Vi nhân giống ớt Capsicum Chinense Jacq. một trong những giống ớt cay nhất thế giới và là thực phẩm truyền thống của người Naga. Tác giá: N. Gayathri, M. Gopalakrishnan and T. Sekar. Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô thực vật, Khoa nghiên cứu thực vật học và P.G, Cao đẳng Pachaiyappa, Đại học Madras, Chennai, Tamil Nadu, Ấn Độ
Tóm tắt:
Quy trình vi nhân giống in vitro được phát triển cho loài Capsicum chinense Jacq., một trong những giống ớt cay nhất thế giới và là thực phẩm truyền thống của người Naga. Nagaland được cho là nơi khởi nguồn của các loại ớt. Sách kỉ lục Guinness thế giới đã ghi nhận đây là loài ớt cay nhất, mỗi quả có chứa 1.041.427 đơn vị cay Scoville (SHU). Nhân giống in vitro đóng vai trò quan trọng trong việc bảo tồn, lưu giữ nguồn gen ban đầu của thực vật, cải tiến mùa vụ và tạo ra các giống cây kháng lại bệnh tật. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng kết hợp ở các nồng độ khác nhau đem lại hiệu quả sản sinh ra nhiều chồi và tạo mô sẹo. Nghiên cứu này cho thấy môi trường MS bổ sung chỉ riêng BAP hoặc kết hợp với IAA, Adenine Sulphate tạo ra nhiều chồi. Số lượng chồi nhiều nhất xuất hiện trong môi trường MS + 19,98 µM BAP + 5,71 µM IAA, và MS+13,31 µM BAP + 13,56 µM Adenine sulphate. Tạo thành công mô sẹo từ lá và phần đốt của cây nuôi cấy in vitro trong môi trường MS có sự kết hợp của 6,66 µM BAP với 9,05 µM 2.4-D, và 6,66 µM BAP với 8,06 µM NAA. Cây tạo rễ trên môi trường MS chứa 7,36 µM IBA, cây đã ra rễ được trồng trong đất vô trùng để thích nghi với điều kiện trong nhà kính cho phát triển về sau.
Từ khóa: vi nhân giống in vitro, ớt Habenaro - Capsicum Chinense, nhân chồi, tạo mô sẹo.
GIỚI THIỆU
Capsicum chinense Jacq. là lòai thảo mộc bán lâu năm thuộc họ Solanaceae, là cây bản địa ở Đông Bắc Ấn Độ và được trồng ở Tây Bengal và Nagaland. Capsicum chinense Jacq. được xác nhận là loài ớt cây nhất thế giới trong sách kỉ lục Guinness thế giới (2006). Nó được gọi theo tiếng địa phương là Bhut jolokia, Naga jolokia, Bih jolokia [1, 2]
Áp dụng Công nghệ sinh học hiện đại để nâng cao năng suất của giống ớt habenaro cần có một quy trình in vitro hiệu quả. Để phát triển nhân giống các giống cây thương mại cho loài này và đáp ứng được nhu cầu cho mùa vụ ngày càng gia tăng, cần có nhiều hơn nữa nhưng cách nhân giống đáng tin cậy để nhân nhanh số lượng. Việc nhân giống ớt habenaro từ hạt bị hạn chế bởi vì thời gian tồn tại ngắn với tỉ lệ nảy mầm thấp, đồng thời rất dễ bị ảnh hưởng bởi nấm và virut gây bệnh [3].
Việc nhân giống trong tự nhiên đối với ớt gặp hạn chế, vì vậy việc bảo tồn nguồn gen thuần của chúng rất quan trọng thông qua vi nhân giống. Loài ớt này có một vài dược tính như chống viêm, giảm đau, kích thích trung tiện, làm xung huyết da và cũng có chất chống oxy hóa mạnh, chống gây đột biến, chống khối u, giảm glucose trong máu, kháng nấm và kháng khuẩn, những dược tính này được trình bày trong nghiên cứu ở tài liệu tham khảo [4]. Nó cũng được sử dụng như chất kích thích để chữa bệnh thấp khớp, đau thắt lưng và đau dây thần kinh. Được sử dụng phổ biến trong cả hai hệ thống y học “Ayurveda” và “Homoepathy”.
Nhân giống in vitro từ đỉnh chồi và chồi nách là cách dễ dàng và kinh tế hơn để có số lượng lớn cây sạch bệnh, đồng nhất và giữ được đặc tính ban đầu của cây mẹ chỉ trong thời gian ngắn. Mặc dù, nhiều người đã cố gắng thực hiện nhưng không có được kết quả như mong đợi trong việc gia tăng số tượng chồi, điều này là bởi vì khả năng tái sinh của giống này rất thấp. Vì vậy, thật cần thiết khi phát triển một quy trình hiệu quả cho vi nhân giống in vitro loài ớt haberano này để có thể tiếp tục nhân giống về sau [5]. Độ cay của ớt thường được đo bằng đơn vị cay Scoville (SHU) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp này thường định lượng luôn cả vị cay và chất capsaicin trong cùng một mẫu ớt [6]
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được thêm vào môi trường MS với những nồng độ khác và kết hợp với Adenine sulphate, đã cho thấy hiệu quả trong việc nhân chồi ở loài Capsicum chinense Jacq.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thu nhận vật liệu
Những quả ớt chín, khỏe mạnh và tươi được thu từ nông trại và chợ địa phương ở Assam và Gwahati, đem trồng trong chậu đất trong nhà có bóng mát thuộc Khoa thực vật học trường Đại học Pachaiyappa, Tamilnadu, Ấn Độ.
Chuẩn bị mẫu vật
Hạt được lấy ra khỏi quả bằng kẹp, và được gieo vào các chậu khác nhau, đặt trong nhà có bóng mát để duy trì độ ẩm bởi vì đây là cây ưu nắng [7]. Hạt được khử trùng bằng ethanol 70% khoảng 60 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 đến 4 lần. Tiếp theo là khử trùng bề mặt với chất tẩy labolene khoảng 5 phút và thuốc diệt nấm bavistin 0.1% trong điều kiện vô trùng khoảng 5 phút, sau đó rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùng. Tiếp theo, hạt được cấy vào đĩa petri có chứa giấy lọc đã được ngâm trong nước cất hai lần và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 7-10 ngày ở 25±2°C. Sau khi nảy mầm, chuyền sang ống nghiệm nuôi cấy có chứa môi trường MS và để cho phát triển khoảng 1 tuần [8]. Những cây con này sẽ được sử dụng cho quá trình sau này. Đỉnh chồi, chồi nách, lá, phần đốt và lóng của Capsicum chinense được sử dụng làm mẫu vật cho các nghiên cứu sau.
Chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy
Môi trường MS có chứa chất điều hòa sinh trưởng như BAP, IAA, Ad.S (Adenine sulphate), NAA, 2,4-D, được bổ sung theo những nồng độ khác nhau. Sucrose được sử dụng làm nguồn carbon 3% (W/V), 0,4% (W/V) Phytagel - chất làm đông đặc, môi trường được chỉnh về pH 5,8 - 6,0. Môi trường này được hấp khử trùng ở 121oC, khoảng 10 phút, với áp suất 150 psi. Việc nuôi cấy tiến hành ở nhiệt độ 24±2°C, chu kì sáng là 16 giờ, cường độ ánh sáng 3000 lux và chu kì tối là 8 giờ [9].
Kích thích nhân nhiều chồi
Đỉnh chồi, phần đốt và chồi nách được sử dụng làm mẫu vật. Mẫu vật được cấy vào môi trường MS chứa 3% (W/V) sucrose, 0,4% (W/V) Phytagel và bổ sung chỉ riêng BAP, hoặc kết hợp với 5,71 µ IAA và Adenine Sulphate để cảm ứng tạo chồi [7]. Số lượng chồi mới phát triển trên mẫu vật đỉnh chồi được ghi nhận lại sau 4 tuần nuôi cấy.
Tạo mô sẹo in vitro và tái sinh cây mới
Các đoạn lóng từ đỉnh đã phát triển trong điều kiện in vitro được sử dụng làm mẫu vật. Lá và mô sẹo sinh ra trên môi trường MS có bổ sung BAP, NAA và 2,4-D ở những nồng độ khác nhau. Mô sẹo phát triển được nuôi cấy trong môi trường nhân chồi cho giai đoạn tái sinh cây mới [10].
Bố trí thí nghiệm và phân tích thống kê
Thí nghiệm được tiến hành theo bố trí nhân tố hoàn hoàn ngẫu nghiên. Dữ liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS và phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) để tìm ra những ảnh hưởng đáng kể.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hạt nảy mầm sau 7 ngày nuôi cấy và 95% hạt giống được vô trùng. Tái sinh invitro loài Capsicum chinense Jacq. (Ớt Naga King) từ mẫu vật chồi và mô sẹo trên môi trường MS bổ sung auxin và cytokinin ở các nồng độ khác nhau. Tái sinh cây loài Capsicum từ đốt và đỉnh chồi được ghi nhận là khó khăn, bởi vì mô sẹo sắp xếp lỏng lẻo, bở rời, màu xanh nhợt nhạt sau 30 ngày nuôi cấy.
Kích thích nhân nhiều chồi
Một quy trình hiệu quả được phát triển để nhân chồi trong điều kiện in vitro và kết quả đạt được là có trung bình 3-4 chồi phát sinh trên mỗi mẫu vật nuôi cấy [18,19]. Số lượng lớn nhất được quan sát thấy trên môi trường MS bổ sung BAP + IAA (19.98 µM +5.71 µM), BAP + Ad.S (13.31 µM +13.56 µM) [12,13,14]. Chồi được nhân lên trong điều kiện có nồng độ cao BAP được bổ sung một mình, hoặc kết hợp với nồng độ thấp IAA, hay kết hợp với Adenine sulphate. Các kết hợp khác nhau được thử nghiệm (Bảng 1) bao gồm môi trường MS cơ bản + 19,98 µM BAP + 5.71 µM IAA, và MS +13.31 µM BAP+13.56 µM Ad.S. Adenine phosphate được cho rằng phù hợp nhất cho nhân chồi Capsicum chinense. Nghiên cứu này chỉ ra rằng môi trường có 19.98+5.71(µM) BAP +IAA và 13.31+13.56 (µM) BAP+Ad.S có số chồi/mẫu vật từ 3.40±0.69 và 3.30 ±0.67, những chồi này được chuyền sang thành công để kéo dài chồi và cho ra rễ. Các thông tin về nhân chồi được ghi nhận sau 14 ngày nuôi cấy. Các chồi này được cắt ra và chuyền vào môi trường MS có chất điều hòa sinh trưởng cho kéo dài chồi và ra rễ. Cũng đạt được kết quả tương tự trên loài Capsicum chinense Jacq. khi môi trường MS có bổ sung TDZ và Zeatin [11,15]
Bảng 1. Ảnh hưởng của các nồng độ BAP, IAA và Ad.S khác nhau lên sự nhân chồi từ các mẫu vật của loài Capsicum chinense Jacq. sau 4 tuần nuôi cấy
|
Môi trường (µM) |
Tỉ lệ phát sinh chồi |
Số lượng chồi (TB±SD) |
Chiều dài chồi (cm) (TB ±SD) |
Số lượng lá(TB ±SD) |
|
BAP+IAA |
|
|
|
|
|
13.31+5.71 |
58.31±0.91 ª |
1.40±0.51 ª |
2.26±0.72 b |
3.90±1.10ª |
|
15.53+5.71 |
64.09±0.8 c |
1.50±0.52 ª |
2.40±0.56 bc |
7.00±0.94 bc |
|
17.74+5.71 |
78.19±0.32 e |
2.50±0.70 b |
2.08±0.58 c |
7.90±1.10 cd |
|
19.98+5.71 |
85.57±0.14 f |
3.40±0.69 c |
3.50±0.52 d |
9.80±1.47 e |
|
BAP+Ad.S |
|
|
|
|
|
13.31+5.42 |
60.14±0.18 b |
1.60±0.51 ª |
1.45±0.28 ª |
4.10±0.56 a |
|
13.31+8.13 |
63.95±0.79 c |
2.40±0.51 b |
2.40±0.51 bc |
6.20±1.22 b |
|
13.31+10.85 |
71.53±0.59 d |
2.60±0.51 b |
2.85±0.47 c |
7.00±0.94 bc |
|
13.31+13.56 |
84.53±0.85 f |
3.30±0.67 c |
3.55±0.49 d |
8.20±1.93 d |
Giá trị trung bình (TB) được theo sau bởi những chữ cái giống nhau thì không có khác biệt đáng kể ở mức xác suất p=0.01
Bảng 2. Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của BAP và IBA lên sự ra rễ Capsicum chinense Jacq. sau 6 tuần nuôi cấy
|
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP)(µM) |
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (IBA) (µM) |
Tỉ lệ phát sinh rễ (TB±SD) |
Số lượng rễ trên mỗi chồi (TB±SD) |
Chiều dài rễ (cm) (TB ±SD) |
|
8.87 |
- |
30.00±8.16 ª |
2.40±0.69 ª |
2.55±0.68 ª |
|
11.09 |
- |
39.53±6.83 b |
3.00±0.94 ab |
3.31±0.41 b |
|
13.31 |
- |
45.58±9.55 b |
3.30±1.05 b |
3.42±0.20 b |
|
8.87 |
3.68 |
39.00±7.37 b |
2.80±0.91 ab |
3.49±0.27 b |
|
8.87 |
4.90 |
42.84±5.64 b |
4.10±0.31 c |
4.42±0.24 c |
|
8.87 |
7.36 |
56.72±8.96 c |
4.60±0.69 c |
4.54±0.22 c |
Giá trị trung bình (TB) được theo sau bởi những chữ cái giống nhau thì không có khác biệt đáng kể ở mức xác suất p=0.01
Bảng 3. Các biểu hiện của mô sẹo khi có sự kết hợp của các hóc môn (µM)
|
Kết hợp hóc môn (µM) |
Phát sinh |
Tỉ lệ biểu hiện |
Màu và kết cấu |
|
BAP |
2,4-D |
NAA |
|
|
|
|
8.87 |
- |
- |
Trung bình |
60 |
Trắng, bở rời |
|
11.09 |
- |
- |
Trung bình |
67 |
Mềm, trắng, bở rời |
|
13.31 |
- |
- |
Trung bình |
70 |
Mềm, trắng, bở rời |
|
4.44 |
4.52 |
- |
Cao |
80 |
Mềm, trắng, bở rời |
|
4.44 |
6.78 |
- |
Cao |
83 |
Mềm, trắng, bở rời |
|
6.66 |
9.05 |
- |
Cao |
87 |
Mềm, trắng, bở rời |
|
4.44 |
- |
5.37 |
Cao |
83 |
Xanh nhạt |
|
4.44 |
- |
6.71 |
Cao |
84 |
Xanh nhạt, rắn chắc và trắng nhạt |
|
6.66 |
- |
8.06 |
Cao |
87 |
Xanh nhạt, rắn chắc và trắng nhạt |
Tạo mô sẹo
Kết quả tạo mô sẹo trong các ống nghiệm nuôi cấy có sự kết hợp các hóc môn sinh trưởng với nồng độ khác nhau được thể hiện trong bảng 3. Các loại mẫu vật như đốt, lóng và mảnh lá có biểu hiện tốt hơn trong việc tạo sẹo, nhất là các mẫu lá, cho kết quả 90% khả năng hình thành mô sẹo. Hầu hết lá sản sinh ra mô sẹo trắng, bở rời; các lóng tạo sẹo rắn chắc, xanh nhạt và các sẹo có màu kem. Hầu hết các mô sẹo ở dạng hạt bở rời ban đầu có màu trắng, chúng chuyển sang màu kem ở giai đoạn cấy chuyền thứ hai. Bởi vì sự phát triển nhanh chóng và mật độ tế bào huyền phù, nên việc cấy chuyền được tiến hành mỗi 14 ngày một lần. Độ xốp và đặc của mô sẹo biểu hiện qua các cấp độ xanh khác nhau, và cũng có màu trắng kem và màu nâu. Mô sẹo xốp và đặc phát triển nhanh chóng và chuyển sang màu nâu. Mẫu vật được nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung các nồng độ kết hợp khác nhau của BAP, NAA và 2,4-D, đã tạo thành công mô sẹo [10]. Môi trường MS cơ bản + 6.66 µM BAP + 8.06 µM NAA, MS +6.66 µM BAP+ 9.05 µM 2,4-D, đều làm cho mô sẹo phát triển. 90% các thí nghiệm nuôi cấy đều cho kết quả tạo mô sẹo (hình 2). Mô sẹo được hình thành sau 2 tuần nuôi cấy. Cây được tái sinh từ mô sẹo trong môi trường MS bổ sung 19.98 µM BAP +5.71µM IAA [16]
Hình 1: Ảnh hưởng của 6-benzylamino purine, Indole 3-acetic acid và Adenine sulphate lên sự tạo chồi của loài ớt Naga king Capsicum chinense Jacq. trong môi trường MS. (a-c) Chồi hình thành từ phần đốt của mẫu vật trên môi trường MS bổ sung BAP + IAA, BAP + Ad.S sau 16 ngày nuôi cấy; (d-e) phát triển thêm chồi mới; (f-g) tạo rễ từ chồi tái sinh trên môi trường MA bổ sung IBA ở các nồng độ khác nhau; (h) Cây con Capsicum chinense Jacq. hoàn chỉnh, đã phát triển in vitro; (i) giai đoạn thích nghi: trồng cây trong túi polythene có chứa hỗn hợp rắn.
Kéo dài chồi và tạo rễ
Các chồi tạo rễ và kéo dài trong môi trường chứa IAA và IBA. Chồi mọc rễ trong môi trường chứa 8.87µM BAP và7.36 µM IBA, thì rất dài và rễ dày [17]. Số lượng rễ tăng lên khi bổ sung loại hóc môn và nồng độ phù hợp. Bảng 2, thể hiện kết quả ra rễ và tỉ lệ ra rễ. Những cây đã ra rễ được cắt bỏ ngọn và sử dụng để kích thích ra chồi bên, nhờ vào đó các cây con nhanh chóng được nhân lên trong thời gian ngắn [18,19].
Hình 2. Mô sẹo được hình thành từ lá, đốt và lóng trên môi trường MS bổ sung chỉ riêng BAP, BAP+2.4-D, BAP+NAA; (a-b) mô sẹo trắng, bở rời; (c-d) mô sẹo phát sinh từ lá; (e-f) mô sẹo xanh; (g-h) nhân khối lượng mô sẹo; (i) mô sẹo màu nâu nhạt
KẾT LUẬN
Thí nghiệm nghiên cứu cho thấy rằng một quy trình chuẩn và đơn giản cho vi nhân giống in vitro Capsicum chinense từ phần đốt và đỉnh chồi sẽ giúp tạo ra cây sạch bệnh và đồng nhất. Sử dụng BAP, BAP+IAA, BAP+Ad.S, BAP+NAA, và BAP+2,4-D giúp cây phát triển và tạo sẹo [10]. Kết quả về sự nảy chồi và kéo dài chồi từ các mẫu vật tương tự với nghiên cứu của Christoper và Rajan, Sanatombi K và Sharma GJ. Quy trình này có thể được áp dụng để bảo tồn và nhân giống quy mô lớn cho các kiểu gen khác của loài ớt habenaro này [11,19]
Lời cảm ơn
Nhóm tác giả gửi lời cảm ơn đến Hiệu trưởng và Tiến sĩ K.M.Umarajan, trưởng khoa Thực vật học đã tạo điều kiện và khuyến khích thực hiện công trình nghiên cứu này. Nhóm tác giả cũng cảm ơn đến những cộng tác viên đã tìm và thu nhận hạt giống cho nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Sanatombi K, Sharma GJ.. Biologia Plantarium. 2008; 52:517-520.
[2] Agrawal S., Chandra N, Kothari SL. Plant Cell Tissue Organ cult. 1989, 16:47-55.
[3] Ahmed N, Siddique I, Anis M, Biologia plantarum. 2006; 50:701-704.
[4] Sunil Kumar Pandey et al., Journal of Pharmaceutical science and Technology vol.4 (2), 2012, 821-828.
[5] Kehie, M., Kumaria, S., & Tandon , P. 3 Biotech. 2012;2(1):31-35.
[6] Khomendra Kumar Sarwa et al., Journal of Herbal Medicine and Toxicology 6(2) 7-10 (2012).
[7] Sanatombi K, Sharma GJ. Journal of Food Agriculture and Environment. 2006;4(1):205
[8] Rahul P. Raj, V.D. Glint, K. Nirmal Babu.) Journal of Applied biology and Biotechnology ,pp.030-033,.2015.
[9] H.B. Gururaj, Giridhar et al., Indian journal of Experimental biology, vol.42, Nov. 2004. Pp- 1136-1140
[10] R.K. Jugeswor Mangang, International journal of interdisciplinary and multidisciplinary studies (IJIMS),
2014,vol 1,no.8, 63-66.
[11] Sanatombi K, Sharma GJ, Micropropagation of Capsicum annum L., vol.35, 2007, Not.Bot.Hort. Agrobot.
[12] M.Otroshy, K. Moradi et al.. Trakia Journal of sciences, vol, 9.No. 3. Pp 21-30, 2011.
[13] Ma. Guadalupe Valadez-Bustos. et al,. In vitro cell. Dev. L. Plant , 2009, 45; 650-658. [14] Mechusclie Kehie, et al., Biotech 2012, March; 2(1); 31-35, 205-011-0025-5.
[15] P.R. Manju & I. Sreelatha Kumary, Journal of Tropical Agriculture, 2002, 7-10.
[16] M. M. Rêgo, E. R. Rêgo et al, Madrid,26-29 Agosto, 2013.
[17] Dorota OLSZEWSKA, et al., Turk J Biol, 2014,38; 118-124.
[18] Nagath Joseph Amruthraj et al., International journal of Biology and Pharmaceutical Research 2013, 4(12), 956-964.
[19] Christoper T, Rajam MV. Plant Cell Tissue Organ Cult. 1994 ;38:29.
[20] Nwokem Co, Agbaji EB, Kagbu JA, Ekanem EJ. NY Sci.J. 2010; 3:17-21.
Khải Mùi
SBC Scientific