TỔNG QUAN
 

Nghiên cứu này đã được thực hiện để thiết lập một quy trình vi nhân giống thích hợp để nhân giống quy mô lớn cây chè thông qua nuôi cấy mô từ hạt, chồi đỉnh và các đoạn đốt thân. Hạt có lớp vỏ và không có lớp vỏ được cấy vào môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung các chất điều chỉnh tăng trưởng khác nhau. Việc loại bỏ lớp vỏ hạt cho thấy phản ứng sớm đối với sự hình thành chồi. Sự hình thành chồi cao nhất (75%) thu được từ hạt không có lớp vỏ nuôi cấy trong  môi trường MS cơ bản + BAP 1.5 mg/l trong khi chỉ sử dụng mỗi KIN không thấy phản ứng đối với sự hình thành chồi. Tuy nhiên, trong trường hợp vi nhân giống từ BT2, BT5, TV23 thông qua chồi đỉnh và các đoạn đốt thân, mẫu cấy được nuôi cấy trong MS với BAP 30 mg/l và các nồng độ khác nhau của auxin và cytokinin. Trong số các nồng độ thì ở 3.0 mg/l BAP và IAA 0.05 mg/l, (75% chồi đỉnh và 66.67% các đoạn đốt thân ở BT2) phản ứng với sự hình thành chồi cao nhất. Sự kéo dài chồi cũng được quan sát thấy trong cùng một môi trường khi các chồi tái sinh được nuôi cấy thứ cấp trong khoảng 20-30 ngày. Chiều dài trung bình cao nhất của chồi/mẫu cấy đối với chồi đỉnh (3.5 cm) và các đoạn đốt thân (3.2 cm) đã đạt được trên môi trường MS bán rắn bổ sung với BAP 3.0 mg/l và IAA 0.05 mg/l. Thêm 0.5mg/l GA3 vào môi trường kéo dài chồi có kết quả tối ưu. Hơn nữa, 48% hình thành rễ từ những vi chồi của BT2 được xử lý bằng IBA 300 mg/l sau 30 phút và sau đó chuyển sang chậu đất trồng và giữ cho môi trường tự nhiên. Sau khi cây con đã cứng cáp thì được chuyển sang đồng ruộng và tỷ lệ cây con sống sót là 32%.
 

 

GIỚI THIỆU
 

Chè, đồ uống phổ biến nhất trên thế giới, thu được từ các đọt của cây Camellia sinensis (L). O. Kuntze. Sự nhân giống chè truyền thống được thiết lập tốt, mặc dù mất rất nhiều thời gian và sức lao động do tính chất lâu năm và thời gian thu hoạch dài (4-5 năm). Ngoài ra, nhân giống chè còn chậm do thiếu các tiêu chí lựa chọn đáng tin cậy. Việc nhân giống thực vật là tiêu chuẩn, nhưng bị giới hạn bởi tốc độ nhân giống chậm, khả năng sống sót thấp của một số dòng vô tính, và nhu cầu về vật liệu trồng ban đầu phong phú (Tahardi và cộng sự, 2003). Nghiên cứu về quá trình vi nhân giống chè gần đây đã tập trung vào việc khám phá tiềm năng phôi soma như một phương tiện thao tác và tái tạo thực vật hiệu quả hơn (Tahardi và cộng sự, 2003).
 

Một phương pháp nhân giống in vitro phù hợp sẽ loại bỏ được nhiều vấn đề liên quan đến sự ra rễ của các đoạn cắt thân và đảm bảo sản xuất được các cây trồng đồng nhất. Đối với các loài thuộc Camellia, các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau đã được thử nghiệm trong một số nghiên cứu [Chen (1983), Haldeman và cộng sự, (1987), Kato, M. (1985) và Nakamura, Y. (1987)]. Tuy nhiên, các công trình này nhằm mục đích thiết lập nuôi cấy cơ bản để xác định ảnh hưởng của các mẫu cấy, điều kiện nuôi cấy và sự khác biệt về giống.
 

Hiện nay, phần lớn các cánh đồng chè được trồng với nhiều dòng nhân giống khác nhau. Những cánh đồng của cây chè vi nhân giống và tác động của các hoạt động nuôi cấy đối với việc phát triển cây chè đã được báo cáo trước đó (Marimuthu và Raj Kumar, 2001). Vì những lý do này, cây chè được đưa vào nuôi cấy mô để tái sinh cây trồng và thao tác di truyền. Không giống như các loại cây trồng khác, các báo cáo không có sẵn về sinh lý cơ bản của cây chè vi nhân giống (Marimuthu và Raj Kumar, 2001).
 

Các công trình về nuôi cấy mô cây chè ở Banglades rất hạn chế. Hiện chưa có nhiều nỗ lực nghiên cứu để thiết lập một quy trình vi nhân giống phù hợp cũng như phát triển chất lượng do tốn nhiều thời gian và chi phí cao. Vì những lý do này, chúng tôi có khuynh hướng sâu xa để thiết lập một quy trình vi nhân giống phù hợp tạo ra ý tưởng lớn giúp những người trồng chè có thể nhân giống nhanh bằng cách sử dụng các mẫu cấy khác nhau như hạt giống, đoạn đốt thân, chồi đỉnh, các đoạn lóng thân, vv. Nghiên cứu này đã được thực hiện để phát triển một phương pháp vi nhân giống nhanh chóng và hiệu quả bằng cách sử dụng hạt giống, các đoạn đốt thân và các chồi đỉnh từ những cây chè phát triển ngoài đồng [Camellia sinensis (L). O. Kuntze] thông qua nuôi cấy mô.

 

Thí nghiệm này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Kỹ thuật Di truyền thực vật của Bộ môn Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ sinh học và Khoa Kỹ thuật Thực phẩm và Công nghệ Chè, Đại học Khoa học & Công nghệ Shahjalal (SUST), Sylhet, Bangladesh. Thử nghiệm này đã được tiến hành thông qua biểu đồ sau.

 

 

 

Chi tiết phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày dưới đây

Các hạt chè được thu thập từ ruộng chè Lakkatura, Sylhet. Các đoạn đốt thân và chồi đỉnh được lấy từ các cánh đồng thử nghiệm/nghiên cứu của Phòng Công nghệ Thực phẩm và Công nghệ Chè. Tất cả các loại mẫu cấy đã được cắt tỉa vô trùng và nuôi cấy trên môi trường vi nhân giống thích hợp.

 

Bảng 1: Mẫu cấy của các dòng khác nhau và hạt giống

 

Giống	Mẫu cấy	Số lượng mẫu cấy	Nơi thu thập
BT2	Đốt thân, chồi đỉnh	20 + 20	Cánh đồng thử nghiệm FET
BT5	Đốt thân, chồi đỉnh	20 + 20	Cánh đồng thử nghiệm FET
TV23	Đốt thân, chồi đỉnh	20 + 20	Cánh đồng thử nghiệm FET
Seed (Bi-clone)	Hạt giống (Có và không có vỏ hạt)	20 + 20	Ruộng chè Lakkatura, Sylhet

 

BT = Bangladesh Tea, TV = Tocklai Variety, seed (bi-clone) FET = Food Engineering and Tea Technology

Sau khi thu thập, các mẫu cấy được rửa sạch dưới vòi nước máy trong 30 phút và sau đó được xử lý bằng chất tẩy lỏng (Tween 20) trong 5 phút, tiếp theo ngâm trong dung dịch chất khử trùng (5% v/v) trong 5 phút, sau đó rửa 5 - 10 lần với nước cất. Cuối cùng rửa bằng HgCl2 0.1% trong 10 phút để khử trùng bề mặt mẫu cấy. Mặt khác, hạt giống đã được rửa trong điều kiện vô trùng bằng nước cất vô trùng và được ngâm qua đêm (trong 16 giờ) trong nước cất vô trùng. Quá trình ngâm hạt này dẫn đến sự trương nở hạt và đẩy nhanh quá trình nảy mầm một tuần khi so sánh với sự kiểm soát không ngâm. Các mẫu cấy đơn lẻ được cấy vào ống nghiệm có chứa 20 ml môi trường MS bán rắn vô trùng có và không có các chất điều chỉnh tăng trưởng để tái sinh chồi. Dữ liệu được ghi lại trên cơ sở phản ứng hình thái của các mẫu được cấy vào môi trường.

 

Để ra rễ tốt hơn, cây con được lấy ra rất cẩn thận từ ống nghiệm rồi chuyển sang các chậu nhựa nhỏ có chứa đất vườn, phân và cát theo tỉ lệ 2: 1: 1. Sau khi cấy ghép, các cây con được phủ bằng tấm polythene lớn để duy trì độ ẩm cao và giữ chúng trong buồng sinh trưởng dưới ánh sáng nhân tạo và các cây đã thích nghi thành công được chuyển sang đồng ruộng.

 

Ảnh hưởng của các nồng độ BAP và Kinetin khác nhau lên sự hình thành chồi từ hạt giống:

Sự hình thành chồi in vitro từ hạt giống (có lớp vỏ hạt và không có lớp vỏ hạt) trên môi trường MS cơ bản bổ sung các nồng độ khác nhau của BAP và KIN đã được nghiên cứu. Kết quả của các nghiệm thức được tóm tắt trong bảng 2.

 

Bảng 2: Ảnh hưởng của các kích thích tố khác nhau đối với sự nảy mầm hạt giống Camellia sinensis (không có lớp vỏ hạt) trong môi trường MS bán rắn.

 

PGR	Nồng độ (mg/l)	% Chồi hình thành (A.M ± S.E)
BAP	0.5	25.00±1.66
	1.0	53.33± 2.45
	1.5	75.00± 3.16
	2.0	60.00± 4.47
	2.5	40.00± 4.47
	3.0	35.00± 3.16
KIN	0.5	Không hình thành chồi
	1.0	Không hình thành chồi
	1.5	Không hình thành chồi
	2.0	Không hình thành chồi
	2.5	Không hình thành chồi
	3.0	Không hình thành chồi

Hình 1. Ảnh hưởng của lớp hạt lên sự hình thành chồi của C.sinensis.

 

Camellia sinensis có hai lớp vỏ hạt. Một số hạt đã được cấy vào môi trường với lớp vỏ hạt và một số không có lớp vỏ hạt. Tỷ lệ hình thành chồi cao hơn ở hạt không có lớp vỏ hạt (hình 1). Trong tất cả các cách, hạt được xử lý với BAP 1.5 mg/l cho thấy sự hình thành chồi cao nhất (với hạt giống còn lớp vỏ là 45 ± 2.16% và không có lớp vỏ 75 ± 3.16%) (hình.1). Mặt khác, nồng độ BAP cũng cho thấy mức độ phản ứng khác nhau đối với sự hình thành chồi. Nhưng chỉ riêng KIN không có phản ứng nào đối với ở bất kỳ nồng độ nào (bảng 2).

 

 

Hình 2. Sự hình thành chồi của C. sinensis khi a, b, c thể hiện sự hình thành chồi nhanh của hạt không có lớp vỏ và d, e, f thể hiện sự hình thành chồi không tốt của hạt giống còn lớp vỏ hạt. Trong mỗi trường hợp, hạt được cấy với môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 1.5 mg/l.

 

Sự tăng trưởng của chồi in vitro từ chồi đỉnh và đoạn đốt thân
 

Các chồi đỉnh và đoạn đốt thân của các giống khác nhau (BT2, BT5, và TV23) của Camellia sinensis được nuôi cấy trên môi trường MS bán rắn với các nồng độ hoocmon khác nhau (BAP, KIN, TDZ) để kích thích chồi. Nhìn chung, người ta nhận ra rằng cần bổ sung cytokinin trong nuôi cấy chồi đỉnh của các cây thân gỗ (Dodds và J.H, 1983). Nakamura (1988) báo cáo rằng việc bổ sung cytokinin là điều cần thiết cho sự phát triển của chồi đỉnh cây chè và ông đã phát hiện ra những chồi phát triển nhanh hơn với lá lớn hơn trong môi trường MS với BAP 3.0 mg/l.

 

Hình 3. Ảnh hưởng của các loại hormone cytokinin khác nhau đối với sự tái sinh chồi từ chồi đỉnh của 3 loại chè khác nhau

 

Trong ba loại giống khác nhau được thử nghiệm với các chất điều chỉnh tăng trưởng khác nhau, BT2 cho thấy đã đáp ứng tốt hơn ở các nồng độ khác nhau của BAP đối với sự tái sinh của chồi so với BT5 và TV23 (Hình.3). Mặt khác, tỉ lệ hình thành chồi từ BT5 và TV23 ở mức trung bình đối với khi sử dụng các chất điều chỉnh tăng trưởng khác (hình 3).
 

Các mẫu được cấy (chồi đỉnh và các đoạn đốt thân) được tái sinh trên môi trường MS chỉ chứa BAP nhưng sự tăng sinh chồi tốt nhất được quan sát thấy khi có sự kết hợp của auxin và cytokinin. Phản ứng tốt nhất đã được quan sát thấy từ các mẫu cấy chồi đỉnh (Hình 4b) và các đốt thân (3.4 cm/mẫu cấy) trong môi trường MS với BAP 3.0 mg/l và IAA 0.05 mg/l, (Bảng 3). Sự hình thành chồi nhân nhanh không xảy ra trên tất cả các nồng độ đã được thử trong quá trình nghiên cứu này. Việc lặp lại quá trình nuôi cấy thứ cấp của các vi chồi trong cùng môi trường dẫn đến sự kích thích và sự kéo dài của chồi. Sựu kết hợp BAP với NAA hoặc chỉ mỗi BAP không thích hợp hơn so với BAP và IAA đối với sự kích thích chồi (Bảng 3).

 

Bảng 3: Ảnh hưởng của các chất điều chỉnh tăng trưởng khác nhau trong môi trường MS bán rắn đối với phản ứng hình thái của Camellia sinensis (L). O. Kuntze (BT2) từ chồi đỉnh và đoạn đốt thân

Chất điều chỉnh tăng trưởng (mg/l)

 

Chất điều chỉnh tăng trưởng (mg/l)					Chồi đỉnh			Đoạn đốt thân
BAP	NAA	IAA	Kn	TDZ	% Mẫu cấy hình thành chồi	Thời gian hình thành chồi (ngày)	Chiều dài trung bình chồi (cm)	% Mẫu cấy hình thành chồi	Thời gian hình thành chồi (ngày)	Chiều dài trung bình chồi (cm)
3.0	0.1				18	40 - 45	1.1	20	40 - 45	1.5
3.0	0.5				14	35 – 37	1.5	24	38 - 40	2.0
3.0	1.0				24	33 – 37	2.2	26	30 - 35	2.2
3.0	1.5				30	35 - 40	3.4	28	35 - 38	3.3
3.0	2.0				22	33 - 38	2.5	27	33 - 38	3.0
3.0		0.01			24	28 - 30	1.9	28	30 – 32	1.2
3.0		0.05			75	30 - 35	3.5	66.67	28 - 33	3.2
3.0		0.10			20	33 - 34	2.0	22	30 - 33	1.0
3.0		0.50			12	32 - 36	2.2	16	30 - 32	1.3
3.0		1.00			16	30 - 33	1.8	08	27 - 29	1.0
3.0			0.1		10	30 – 32	1.5	08	28- 30	2.1
3.0			0.5		16	30 -33	2.7	12	28 - 33	2.0
3.0			1.0		24	28 - 32	3.8	24	30 - 37	2.2
3.0			1.5		22	30 -34	2.1	22	30 - 35	1.9
3.0			2.0		19	30 - 33	2.0	16	35 - 40	1.7
		0.01		3.0	32	40 -42	1.5	29	35 - 37	1.0
		0.05		3.0	28	35 – 40	2.2	28	30 - 32	1.3
		0.10		3.0	36	32 - 36	2.8	32	30 - 33	2.6
		0.50		3.0	24	30 - 35	2.4	22	33 - 37	2.2
		1.00		3.0	16	35 - 37	1.0	24	32 - 35	1.4

 

Hình 4. Sự kích thích và sự kéo dài chồi từ chồi đỉnh của C. sinensis trong môi trường MS bổ sung BAP (3.0mg/l)

 

Người ta thấy rằng khi tăng nồng độ BAP đã làm giảm số lượng chồi, xuất hiện hoại tử và những chồi biến dị. Borchrtia và cộng sự (2009) quan sát thấy rằng số lượng chồi giảm có thể là do sự ức chế sự kéo dài của mô phân sinh ngẫu nhiên khi sử dụng nồng độ BAP cao hơn. Trong nuôi cấy chồi đỉnh của Camellia japonica, nồng độ BA thích hợp là 0.5 -1.0 mg/l (Samartin và cộng sự, 1984) và ở C. sinensis là 0.5 - 3.0 mg/l (Chen và cộng sự, 1983). Do đó, trong nghiên cứu, có vẻ như nồng độ thích hợp của BAP dao động trong khoảng 1.5 – 3.0 mg/l trong nuôi cấy chồi đỉnh của cây chè.

 

Bảng 4: Ảnh hưởng của IBA (300 mg/l) lên sự hình thành rễ

 

Thời gian xử lý với IBA 300mg/l (min)	Số lượng chồi chuyển ra đất	% Chồi phản ứng ra rễ	Số ngày bắt đầu hình thành rễ	Chiều dài rễ/chồi (cm)  sau 60 ngày
10	8	-	-	-
20	8	25	62	1.5
30	8	48	60	2.4
40	8	20	68	1.0
50	8	Hoại tử	-	-

 

Phương pháp vi nhân giống đơn giản và đáng tin cậy là cắt đoạn đốt thân in vitro (Vieitez và cộng sự, 1989). Trong thí nghiệm này, các đoạn đốt thân với chồi nách được nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung các loại hoocmon đơn lẻ hoặc kết hợp khác nhau (Bảng 3). Để tìm ra sự kết hợp hormon tốt nhất cho sự tăng sinh và sự kéo dài của chồi từ đoạn đốt thân, có rất nhiều sự kết hợp đã được thực hiện. Người ta phát hiện ra rằng sự tăng trưởng của chồi từ đoạn đốt thân tăng lên trên môi trường MS có bổ sung BAP (1.0 – 3.0 mg/l). Do đó, dường như nồng độ phù hợp của BAP dao động từ 0.5 đến 3.0 mg/l Khi nuôi cấy chồi đỉnh và đoạn đốt thân của Camellia sinensis. Để chồi đỉnh tăng trưởng tốt hơn, Cytokinins kết hợp với auxins ở các nồng độ khác nhau đã được thực hiện. Tuy nhiên, sự kết hợp giữa BAP (3.0 mg/l) và IAA (0.05 mg/l) kích thích sự phát triển của chồi đỉnh ở mức độ lớn hơn so với sự kết hợp khác (Bảng 3). 
 

Hơn 48% chồi được tái sinh từ chồi đỉnh đã ra rễ (hình 4b). Trong nghiên cứu này, sự kích thích  rễ đã được quan sát thấy từ các mẫu cấy của chồi đỉnh, khi các chồi tăng sinh (2.5 - 3.0 cm) được xử lý với IBA 300 mg/l trong 30 phút và sau đó chuyển sang chậu nhựa có chứa đất vườn, phân và cát trong Tỷ lệ 2: 1: 1. Sau 60 ngày, tỉ lệ cây ra rễ đã được ghi nhận và các cây con khỏe mạnh được giữ trong phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC (ngày)/ 20oC (đêm), 16 giờ và độ ẩm 70%. Khi bắt đầu xuất hiện 1-3 lá, cây con được chuyển sang một chậu khác có chứa hỗn hợp đất và phủ bằng polythene trong suốt. Những cây này đã được tiếp xúc với môi trường trong một giờ mỗi ngày và sau đó lại được đặt trong phòng tăng trưởng trong một tuần nữa. Tỷ lệ sống sót cuối cùng là 32% sau 60 ngày. Sự ra rễ từ chồi cũng được báo cáo bởi các tác giả khác nhau (Chen, J.S., 1984, Kato, M., 1985, Nakamura, Y., 1987, Samartin và cộng sự, 1989). Sharma và các cộng sự (1999) báo cáo tỷ lệ sống sót phụ thuộc vào việc duy trì trong buồng giúp cây cứng cáp đặc biệt được thiết kế để kiểm soát pH của đất, làm giàu CO2, điều kiện ánh sáng và độ ẩm tương đối. Kỹ thuật này có thể áp dụng cho việc vi nhân giống và trồng trọt quy mô lớn để ngành công nghiệp chè tại Bangladesh phát triển bền vững.
 

Agarwal, U. Singh, and M. Banerjee. 1992. In vitro clonal propagation of tea (Camellia sinensis

(L.) O. Kuntze), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 30(1): 1-5.

Andrade, S. Echeverrigaray, F. Fracaro. 1999. The effect of growth regulators on shoot propagation and rooting of common lavender (Lavandula vera DC), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56(2):79-83.

Banerjee, and B. Agarwal. 1990. In vitro rooting of tea, Camellia sinensis (L.) O. Kuntze, Indian Journal of Experimental Biology, 28: 936-939.

Borchetia, S. C. Das, P. J. Handique. 2009. High multiplication frequency and genetic stability for commercialization of the three varieties of micro propagated tea plants (Camellia spp.), Scientia Horticulturae, 120(4): 544-550.

Briggs, S. McCulloch, and L. Edick.1988. Micro propagation of azaleas using thidiazuron, Acta Horticulturae, 227 : 330-333.

Boonerjee, S., Hoque, M.I. and Sarker, R.H.2013. Development of in vitro micropropagation system in tea plant (Camellia sinensis (L). O. Kuntze) using shoot tips and nodal segments

C.Evans. 1999. Implications of the mechanisms of action of tea polyphenols as antioxidants in vitro for chemoprevention in humans, Proceedings of the Society for experimental Biology and Medicine, 220(4): 262-266.

Chen, J, S.1983. Formation of multiple shoots from tea shoots tip culture. Taiwan Tea Res. Bull., 2: 1-9

Chen, J.S. (1984). Sterilization and root formation of tea shoot tip culture, Taiwan Tea Res. Bull, 3: 115-121

Dodds, J.H. 1983. Tissue culture of trees, American Edition, Avi Publish Co. Westport, Connecticut.

F. Ghanati, M. Rahmati Ishka. 2009. Investigation of the interaction between abscisic acid (ABA) and excess benzyladenine (BA) on the formation of shoot in tissue culture of tea (Camellia sinensis L.), International Journal of Plant Production 3 (4):7-14.

Fasolo, R. H. Zimmerman and I. Fordham. 1989. Adventitious shoot formation on excised leaves of in vitro grown shoots of apple cultivars, Plant Cell, Tissue and Organ Culture,16(2): 75- 87 .

Fung, K. F.; Zhang, Z. Q.; Wong, J. W. C.; Wong, M. H. 1999. Fluoride contents in tea and soil from tea plantations and the release of fluoride into tea liquor during infusion, Environmental Pollution, 104 (2): 197.

Gribaudo, and A. Fronda. 1991. Effects of thidiazuron on grapevine axillary buds cultivated in vitro, HortScience, 26(8): 1083, 1991.

Haldeman,  J.H., Thomas, R,  L,  Mckamy,  D.L.1987. Use of  benomyl  and  riflampicin  for in  vitro

shoot tip culture of Camellia sinensis and C. Japonica, HortScience, 22: 306-307  Huetteman,  and  J.  E.  Preece.  1993.  Thidiazuron:  a  potent  cytokinin  for  woody  plant  tissue

culture, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 33(2): 105-119.

I. Sandal, A. Bhattacharya, and P. S. Ahuja. 2001. An efficient liquid culture system for tea shoot proliferation,” Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 65:75-80.

J. E. Preece, and M. R. Imel. 1991. Plant regeneration from leaf explants of Rhododendron `P.J.M. Hybrids', Scientia Horticulturae, 48(1-2): 159-170.

Jha, and S. K. Sen.1992. Micro propagation of an elite Darjeeling tea clone, Plant Cell Reports, 11: 101-104.

Kato M.1986. Micro propagation through cotyledon culture in Camellia sasanquva. Japan Journal of Breeding, 36: 82 - 83.

Kato, M.1985. Regeneration of plantlets from tea stem callus, Jpn.J.Breed, 35: 317-322

M. Suganthi, S. Arvinth, R. Raj Kumar. 2012. Impact of Osmotica and Abscisic Acid on Direct Somatic Embryogenesis in Tea, International Journal of Plant Research, 2(2): 22-27.

 

M. Vieitez, M. L. Vieitez, A. Ballester. 1992. Micropropagation of Camellia spp, Biotechnology in Agriculture and Forestry, Y. P. S. Bajaj, ed., 361-387.

Marimuthu, S. and R. Raj Kumar. 2001. Physiological and Biochemical responses of micro propagated tea plants, In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 37: 618-621.

Mary Lou Heiss; Robert J. Heiss.2011. The Story of Tea: A Cultural History and Drinking Guide.

Random House, 31

Mohammed Faheem, Satyapal Singh, Babeet Singh Tanwer, Moinuddin Khan and Anwar Shahzad. 2011. In vitro Regeneration of multiplication shoots in Catharanthus roseus- An important medicinal plant, Pelagia Research Library,Advances in Applied Science Research,  2 (1): 208-213.

Mondal, T.K. 2004. Biotechnological improvements of tea. ISB News Report, access entire News Report at http://www.isb.vt.edu.

Nakamura, Y. 1987: In vitro rapid plantlet culture from auxiliary buds of tea plant. Bull. Shizuoka Tea Exp. Sta. 13: 23-27 [In Japanese with English sumary]

Phukan, M.K. & Miltra, G.C.1984. Regenerations of tea shoot from nodal explants in tissue culture. Current Science, 53:874-876

Prakash, A. Sood, M. Sharma. 1999. Grafting micro propagated tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] shoots on tea seedlings–a new approach to tea propagation, Plant Cell Reports,18(10), 883-888.

S. Das, T. Barman, and R. Singh. 1990. Plant regeneration and establishment in nursery, Assam Rev. Tea News, 79: 24-27.

S. Singha, and S. Bhatia.1988. Shoot proliferation of pear cultivars on medium containing thidiazuron and benzylaminopurine, HortScience, 23: 803.

Sharma, M., Sood, A., Nagar, P.K., Prakash, O. and Ahuja,P.S. 1999. Direct rooting and hardening  of tea microshoots in the field. Plant Cell Tiss.Org.Cult.,58:111-118

Sirous Bidarigh and Ebrahim Azarpour. 2013. Study effect of BA hormone levels on length shoot in-vitro culture of tea (Camellia sinensis L.), ARPN Journal of Agricultural and Biological Science, 8(1)

S. Singha, and S. Bhatia.1998. Shoot proliferation of pear cultivars on medium containing thidiazuron and benzylaminopurine, HortScience, 23:803.

Samartin, A., Vieitz, A.M. & Vieitez, E. 1984. In Vitro propagation of Camellia japonica seedling.

Hortscience, 19: 225-226

Sandal, A. Bhattacharya, and P. S. Ahuja. 2001. An efficient liquid culture system for tea shoot proliferation, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 65:75-80.

Sghaier, B., Kriaa, W., Bahloul, M., Jorrı´n Novo, J.V., Drira, N. 2009. Effect of ABA, arginine and sucrose on protein content of date palm somatic Embryos, Scientia Horticulturae, 120: 379-385.

T. K. Mondal, A. Bhattacharya, A. Sood. 1998. Micro propagation of tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) using Thidiazuron, Plant Growth Regulation, 26(1): 57-61.

T. K. Mondal, A. Bhattacharya, M. Laxmikumaran.2004. Recent advances of tea (Camellia sinensis) biotechnology, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 76(3):195-254.

T. K. Mondal. 2003. Micro propagation of tea (Camellia sinensis), Micro propagation of woody trees and fruits, S. M. Jain and K. Ishii, eds.pp. 671–720.

T. Murashige, and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Physiologia Pantarum, 15(3): 473-497.

T. Phan. 1991.Vitreous state in vitro culture: ethylene versus cytokinin, Plant Cell Reports, 9(9): 517-519.

Tahardi, J.S. and W.A. Imron Riadi, Dodd. 2003. Enhancement of somatic embryo and plantlet recovery in Camellia sinensis by temporary liquid immersion, J. Biotechnology Pertanian,  8: 1-7

Thayamini H. Seran, K. Hirimburegama and M. T. K. Gunasekare. 2007. Production of embryogenic callus from leaf explants of Camellia sinensis (L.), J. Natn.Sci.Foundation Sri Lanka 35(3): 191-196

Y. Nakamura. 1987. Shoot tip culture of tea cultivar Yabukita, Tea Research Journal, 65: 1-7.

 

Yamamoto, T; Kim, M; Juneja, L R.1997. Chemistry and Applications of Green Tea. CRC Press, 4.

Vieitez, A., Barciela, J. & Ballester, A, 1989. Propagation of Camellia japonica cv. Alba Plena by tissue culture, J. Hort.Sci.64: 177-182