Chúng tôi phát triển một quy trình mới để nhân giống in vitro loài lan thuộc chi Phalaenopsis (chi Lan Hồ Điệp). Khác với các phương pháp nhân giống thông thường chủ yếu sử dụng mô lá, rễ hoặc đỉnh chồi, trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng vật liệu nuôi cấy ban đầu là phần thân của cây non đã được kéo dài bằng 6-benzyladenine. Phần thân đã kéo dài bao gồm các mắt ngủ, trong đó các mắt ngủ đỉnh được sử dụng để tạo mẫu cho chu kỳ nhân giống mới và các mắt ở giữa dùng để tạo chồi ngọn hoặc nhiều chồi bất định. Toàn bộ quy trình nhân giống có thể hoàn thành trong 7 tháng, và khoảng 2,300 cây con được tạo ra từ một mẫu thân đơn chỉ trong 1 năm. Phương pháp này có thể được sử dụng để nhân cây giống trong trường hợp thiếu hạt giống lan hoặc để nhân giống chồi sinh dưỡng phát triển từ các phát hoa của nhiều loài lan hiếm khi mà những phát hoa này cũng có   giới hạn. Quy trình này cũng có tiềm năng trong việc nhân giống các loài lan hoang dã đang bị đe dọa.
 

Từ khóa: Lan Hồ Điệp – Nhân giống in vitro – Cytokinin – Sự kéo dài thân

Chi Phalaenopsis là một trong những chi lan quan trọng nhất trên thị trường thương mại. Nhân giống vô tính thường được sử dụng cho một số chi lan, nhưng rất khó để nhân giống vô tính Phalaenopsis bởi vì chúng là loài lan đơn thân không thể nhân giống bằng cách nuôi cấy cây con (offshoot -  cây con mọc ra từ thân mẹ – cây Keiki). Các mô lá (Tanaka và cộng sự 1975), phân đoạn và mô chóp rễ (Tanaka và cộng sự 1976, Yoneda và Momose.1988), đỉnh chồi của cây trưởng thành (Intuwong và Sagawa 1974) và phát hoa (Arditti và cộng sự 1977, Homma và Asahira 1985, Ichihashi 1992, Pieper và Zimmer 1976, Zimmer và Pieper 1978) đã được sử dụng như nguồn mẫu ban đầu cho quá trình nhân giống lan in vitro. Mặc dù có một vài quy trình cũng thích hợp cho mục địch thương mại, nhưng vẫn tồn tại một số vấn đề cần giải quyết. Ví dụ, mô lá cần một khoảng thời gian đáng kể để hình thành protocorm-like bodies (PLBs – thể giống protocorm) và phải cấy chuyền thường xuyên để tránh thương tổn do các hợp chất phenolic tiết ra từ các mô (Arditti và Robert 1993). Trong nuôi cấy phát hoa, cũng mất một thời gian dài để hình thành một phát hoa từ cây con, và có tỷ lệ nhân giống thấp. Nuôi cấy đỉnh chồi ngọn gây nguy hiểm cho cây mẹ, và tỷ lệ nhân giống cũng thấp. Để khắc phục những vấn đề này, chúng tôi đã cố gắng phát triển một quy trình mới mà vật liệu sử dụng cho quá trình nhân giống là các mắt ngủ, các mắt ngủ này được cắt từ phần thân đã kéo dài bằng cách xử lý với cytokinin.

 

Mẫu thực vật
 

Cây lai Phalaenopsis (Morning Moon M-28 x Gladys Read St. Louis đã phát triển trong in vitro) một năm tuối được sử dụng để kiểm tra sự tăng trưởng dưới ảnh hưởng của cytokinin. Mẫu cây đã loại bỏ rễ, được chuyển vào môi trường Hyponex chứa 3.5g/L Hyponex (N:P:K = 6.5%:6.0%:19%) thêm zeatin, 2iP, kinetin hoặc BA tại nồng độ 2 và 10mg/L. Chiều dài của thân và số lượng lá, rễ, chồi bất định được ghi nhận sau 60 ngày cấy.
 

Cây Phalaenopsis lai (Wataboushi x Grand City) x Ensyushirakaw được một năm tuổi sử dụng cho thí nghiệm khảo sát nồng độ BA tối ưu để kéo dài thân. BA được thêm vào môi trường Hyponex tại nồng độ từ 0 đến 20mg/L, chiều dài thân được ghi nhận sau 45, 95 và 135 ngày cấy.
 

Bốn mẫu được chuyền vào mỗi erlen. Mười sáu mẫu cho mỗi nghiệm thức trong tất cả các thí nghiệm, và mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất một lần. 

 

Hình 1: Sơ đồ phác họa quy trình nhân giống in vitro loài lan Phalaenopsis bằng nuôi cấy các đoạn mắt ngủ được cảm ứng với cytokinin. Chú thích: top node – mắt ngủ đỉnh; basal node – mắt ngủ phần gốc; other nodes – các mắt ngủ khác; BA free – không bổ sung BA.

 

 

Điều kiện tái sinh
 

Thân đã kéo dài (khoảng 1cm) của cây Phalaenopsis lai (Wataboushi x Grand City) x Ensyushirakaw thu được sau khi cấy 2 tháng trong môi trường Hyponex có bổ sung 5mg/L BA. Phần thân này được loại bỏ lá, sau đó cắt thành bốn đoạn mắt ngủ (mắt ngủ đỉnh bao gồm đỉnh chồi ngọn, mắt ngủ thứ hai, mắt ngủ thứ ba và mắt ngủ phần gốc). Những đoạn mắt ngủ này được đặt riêng trên môi trường Hyponex chứa 2g/L peptone (Difco Laboratories) có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau. Mỗi nghiệm thức được thử nghiệm với mười đoạn mắt và quan sát sự phát triển sau 2 tháng nuôi cấy. Khi các chồi ngọn phát sinh từ những mẫu này, chúng được chuyển sang môi trường Hyponex mới không chứa chất điều hòa tăng trưởng để hình thành rễ. Hình 1 cho thấy toàn bộ quy trình nhân giống được phát triển trong nghiên cứu này.
 

Hai loại vật chứa được sử dụng: Erlen 200ml chứa 70ml môi trường cho thí nghiệm kéo dài thân cây và ống nghiệm 25x150mm chứa 20ml môi trường để nuôi cấy các đoạn mắt ngủ. Tất cả môi trường được bổ sung 10g/L agar (Wako Pure, Nhật Bản) và 25g/L sucrose, chỉnh pH đạt 5.6 trước khi hấp khử trùng tại 121oC với áp suất 1.3kg/cm2 khoảng 15 phút. Tất cả mẫu được nuôi trong phòng cấy ở 25±2oC với chu kỳ sáng 16h và ánh sáng với cường độ 2,500lux sử dụng bóng đèn huỳnh quang. 

Ảnh hưởng của các nồng độ Cytokinin lên sự phát triển của cây giống
 

Tại nồng độ thấp (2mg/L, zeatin, 2ip và kinetin có ít ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của cây giống Phalaenopsis (Morning Moon M-28 x Gladys Read St. Louis). BA đã ức chế sự phát triển của rễ, làm tăng số lượng chồi bất định và chiều dài thân cây (Hình 2A). Cytokinin cũng được thử nghiệm tại nồng độ cao hơn (10mg/L) và cho kết quả như Hình 2B, BA có ảnh hưởng mạnh lên cây giống còn zeatin, 2ip, kinetin có ảnh hưởng yếu hơn. Số lượng chồi bất định hình thành trong nghiệm thức xử lý với BA tăng đến 3.7chồi/mẫu trong khi mẫu đối chứng (không bổ sung cytokinin) lại không xuất hiện chồi con. BA thúc đẩy sự kéo dài thân lên 37% so với nghiệm thức đối chứng. Nhưng ngay cả khi bổ sung với nồng độ cao hơn, các cytokinin lại không có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của lá.

Tối ưu hóa nồng độ BA để kích thích quá trình kéo dài thân
 

Như trên Hình 3, chiều dài thân tăng khi nồng độ BA tăng. Ảnh hưởng của BA cũng rõ ràng hơn khi tăng thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, nếu nồng độ BA cao hơn 10mg/L gây ra một số biến dạng trên lá và cây con. Với nồng độ từ 5 đến 10mg/L, cây con phát triển bình thường mà không bị thủy tinh hóa, và thân cây phát triển hơn so với nghiệm thức đối chứng (Hình 4). Kết quả này cho thấy rằng nồng độ BA trong khoảng 5-10mg/L là tối ưu cho việc kéo dài thân cây trên môi trường Hyponex.
 

Nhân giống những đoạn thân đã phát triển
 

 Mỗi một đoạn mắt ngủ (mắt ngủ đỉnh, mắt ngủ thứ hai, mắt ngủ thứ ba và mắt ngủ phần gốc) được đặt vào môi trường Hyponex có bổ sung BA tại các nồng độ khác nhau. Sau 70 ngày, chồi ngọn và nhiều chồi con bất định đã được sinh ra từ các đoạn mắt, hình thành từ hai đến 3 lá. Hầu hết các chồi ngọn được tạo từ chồi nách, một số chồi ngọn lại phát triển từ các chồi bất định. Số lượng chồi ngọn cao nhất quan sát được từ đoạn mắt ngủ thứ ba (5.2 chồi khi bổ sung 5mg/L BA) và đoạn mắt ngủ thứ hai (6.9 chồi tại nồng độ 10mg/L) (Bảng 1). Đoạn mắt ngủ phần gốc hầu như không tạo chồi ngoại trừ trên môi trường không bổ sung BA. Mỗi đoạn mắt ngủ đỉnh chỉ tạo một chồi trong tất cả các nghiệm thức có và không bổ sung BA (Bảng 1). Vì vậy, các đoạn mắt ngủ đỉnh được sử dụng như nguồn mẫu cho một chu trình vi nhân giống mới, trong khi các đoạn mắt ngủ khác (mắt ngủ ở phần giữa và phần gốc) được sử dụng để nuôi cấy thành cây con (Hình 1).
 

Mặc dù hầu hết các đoạn mắt đều tạo chồi ngọn trong vòng 60 ngày nuôi cấy, nhưng 10% các đoạn mắt cũng tạo ra các chồi bất định (Hình 5). Các chồi bất định này được chia thành nhiều phần và cấy trên môi trường Hyponex có bổ sung BA. Sau 60 đến 90 ngày, khoảng một nửa sô chồi bất định sẽ phát triền thành nhiều chồi ngọn, một số khác sẽ hóa nâu rồi chết. 
 

Tất cả các chồi ngọn từ các mắt ngủ đã nuôi cấy được chuyền sang môi trường Hyponex không chứa BA cố bổ sung 2g/L peptone để kích thích tạo rễ. Những chồi ngọn này cũng tạo rễ và phát triển thành cây con sau 60 đến 70 ngày (Hình 6). Các cây con được chuyển ra khỏi bình cấy để cho vào chậu đất sét có sẵn dớn trắng và được nuôi trong nhà kính theo phương pháp nuôi trồng cây giống chuẩn. 

Bảng 1: Ảnh hưởng của các nồng độ BA trên những đoạn mắt ngủ khác nhau từ thân kéo dài của cây Phalaenopsis lai (Wataboushi x Grand City) x Ensyushirakawa trong môi trường Hyponex in vitro
Nồng độ BA (mg/L)	Số lượng chồi ngọna
	Mắt ngủ gốc	Mắt ngủ thứ hai	Mắt ngủ thứ ba	Mắt ngủ đỉnhb	Tổng
0	3.6±0.4	2.5±0.4	1.5±0.5	1.0±0.0	8.6±0.3
5	0.1±0.1	4.4±0.9	5.2±1.2	1.0±0.0	10.7±0.6
10	0.1±0.1	6.9±0.9	4.5±1.2	1.0±0.0	12.5±0.6
20	0.6±0.4	3.3±0.9	2.4±0.4	1.0±0.0	7.3±0.4
aSau 70 ngày cấy, mỗi kết quả biểu hiện bằng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (n=10) bBao gồm chóp thân

 

 

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy BA thúc đẩy sự kéo dài thân của cây giống Phalaenopsis và các đoạn mắt ngủ cắt từ phần thân cây này được sử dụng như nguồn mẫu để tái sinh nhiều cây con. Phương pháp này cho phép chúng tôi tạo ra hơn 2,300 cây con trong vòng 1 năm từ 1 cây giống đơn được kéo dài thân. Nhiều phương pháp nhân giống vô tính cây Phalaenopsis dựa trên việc sản sinh PLB từ lá, rễ hoặc phát hoa (Arditti và Robert 1993). Tuy nhiên, sự tái sinh PLB từ lá hoặc các loại mô khác thì không dễ và cần tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện nuôi cấy. Ví dụ, việc sản sinh PLBs giảm khi tuổi của cây con tăng (Tanaka và cộng sự 1975). PLBs thu được từ các phát hoa không dễ nhân nhanh, và khả năng sống thấp (Tokuhara và Mii 1993). Không dễ thành công trong việc tạo PLBs. Một vài chóp rễ của Phalaenopsis không thể sản sinh PLBs và cần thời gian nuôi cấy kéo dài (Tanaka và cộng sự 1976). Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, PLBs thu được từ nuôi cấy các phân đoạn lá của cây con Phalaenopsis lai (Wataboushi x Grand City) x Ensyushirakawa nhưng không thu được từ các mẫu nuôi cấy của các dòng lai
Phalaenopsis khác (như Pink Leopard Petra). Trong quy trình này chúng tôi thành công tạo 100% cây giống hoặc cây mẫu để tiến hành kéo dài thân, và hầu hết 100% các đoạn mắt từ phần thân này phát triển thành cây con. Chúng tôi đã thử nghiệm phương pháp của chúng tôi trên dòng lai Phalaenopsis khác (White Dream x Dome Gules), và chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự. Một điều thú vị là chúng tôi còn thành công khi áp dụng phương pháp này để kéo dài thân của chồi ngọn phát sinh từ các phát hoa của loài lan khác (x Doriella Tiny), và tỷ lệ nhân giống khoảng 6,000 lần trong một năm khi sử dụng các đoạn mắt từ phần thân kéo dài (dữ liệu không được công bố). Kết quả của chúng tôi chứng minh rằng phần thân kéo dài bằng BA là nguồn mẫu tốt cho nhân giống vô tính các loài lan. Mặc dù dễ tạo một số lượng lớn cây con trực tiếp từ hạt, phương pháp này có thể sử dụng để nhân cây giống hoặc chồi sinh dưỡng phát triển từ các phát hoa của nhiều loài Phalaenopsis hiếm khi thiếu hạt giống, đặc biệt trong quá trình tạo giống lan Phalaenopsis. Phương pháp này cũng có tiềm năng lớn để nhân giống các loài lan đang bị đe dọa.
 

Ảnh hưởng của BA trên việc tạo hoặc kéo dài chồi ngọn rõ ràng có mối liên quan đến vị trí của các đốt mắt trên thân. Lý do cho hiện tượng này thì chưa được biết đến. Cytokinin ngăn chặn hiên tượng trội đỉnh và kích thích sự phát triển của chồi bên trong một số thực vật (Imre 1987). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, đoạn mắt ngủ đỉnh, bao gồm mô phân sinh đỉnh, luôn chỉ tạo một chồi ngọn dù môi trường có hay không chứa BA (Bảng 1), và chồi ngọn được kéo dài trên môi trường có chứa BA. Dường như mô phân sinh đỉnh luôn duy trì được khả năng trội đỉnh và không cho chồi nách phát triển ngay cả trên môi trường có chứa BA. Không biết lý do tại sao các đoạn mắt ngủ ở gốc hầu như không tạo được chồi ngọn trên môi trường có chứa BA nhưng lại tạo được trên môi trường không bổ sung BA.

Phương pháp của chúng tôi đặc trưng bởi sự đơn giản, chỉ cần ba đến bốn lần cấy chuyền trong suốt quá trình nhân giống, điều này giúp giảm thiểu khả năng nhiễm và chi phí nuôi cấy. Toàn bộ quá trình được hoàn thành trong vòng 7 tháng: 2 tháng để thân cây kéo dài, 3 tháng để các chồi phát triển từ các đoạn mắt, và 2 tháng nữa để cây con hình thành và chuyển sang chậu đất sét.


 

Hình 6: Rễ của các mẫu phát triển từ các đoạn mắt trên môi trường Hyponex không chứa BA sau 60 ngày nuôi cấy

Lời cảm ơn. Chúng tôi xin gửi lòng biết ơn đến S. Sumida vì đã cung cấp cho chúng tôi cây giống Phalaenopsis lai Morning Moon M-28 x Gladys Read St. Louis để sử dụng trong các thí nghiệm trên.

Arditti J, Ball EA, Reisinger DM (1977) Culture of flower-stalkbuds: A method for vegetative propagation of Phalaenopsis. Am Orchid Soc Bull 46:236-240

Arditti J, Robert E (1993) Micropropagation of orchids. John Wiley and Sons, New York, pp. 467-520

Homma Y, Asahira T (1985) New means of Phalaenopsis propagation with internodal sections of flower stalk. J Jpn Soc Hort Sci 54:379-387

Ichihashi S (1992) Micropropagation of Phalaenopsis through the culture of lateral buds from young flower stalks. Lindleyana 7: 208-215

Imre AT (1987) Hormonal regulation of apical dominance. In: Davies PJ (ed) Plant hormones and their role in plant growth and development. Martinus Nijhoff, Dordrecht, pp 397-399

Intuwong O, Sagawa Y (1974) Clonal propagation of Phalaenopsis by shoot tip culture. Am Orchid Soc Bull 43:893-895

Pieper W, Zimmer K (1976) Clonal propagation of Phalaenopsis in vitro. Acta Hort 64:21-23

Tanaka M, HasegawaA, Goi M (1975) Study on the clonal propagation of monopodial orchids by tissue culture. I. Formation of protocorm-likebodies from leaf tissue in Phalaenopsis and Vanda. J Jpn Soc Hort Sci 44:47-58

Tanaka M, Senda Y, HasegawaA (1976) Plantlet formation by root-tip culture in Phalaenopsis. Am Orchid Soc Bull 45:1022-1024

Tokuhara K, Mii M (1993) Micropropagation of Phalaenopsis and Doritaenopsis by culturing shoot tips of flower stalkbuds. Plant Cell Rep 13:7-11 

Yoneda K, Momose H (1988) PLB and plantlet formation by root-tip culture in Phalaenopsis. Bull Coil Agric Vet Med Nihon Univ 45:191-196

Zimmer K, Pieper W (1978) Clonal propagation of Phalaenopsis by excised buds. Orchid Rev 86:223-227

Phương Anh
SBC Scientific