Adigo Setargie [1],  Firew Mekbib [2] và Eyassu Abraha [3]

Phòng Sinh học ĐH Mekelle, Ethiopia [1]

Trường Khoa học cây trồng ĐH Haramaya, Ethiopia [2]

Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Mekelle, Ethiopia [3]
 

Nghiên cứu này đã được tiến hành để phát triển quy trình nhân giống in vitro cây đu đủ lưỡng tính (Carica papaya L.) từ búp chồi. Trong nghiên cứu này, môi trường MS có nồng độ auxin và cytokinin biến đổi khác nhau được sử dụng để đánh giá hiệu quả của cytokinin và auxin, thiết lập môi trường thích hợp cho tái sinh Carica papaya trong điều kiện in vitro. Khởi đầu phát triển và nhân chồi tốt nhất thu được trên môi trường MS với 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L NAA. Số chồi trung bình cao nhất (16), chiều dài chồi cao nhất (1,7 cm) và số lá trung bình (21) được ghi trên môi trường MS với BAP 1,0 mg/L và 0,5 mg/L NAA. Tương tự như vậy, số ngày tối thiểu và tối đa cho sự xuất hiện của chồi tương ứng trên BAP ở mức 0,5 mg/L + 0,5mg/L NAA và BAP ở  mức 2,0 mg/L + 0,5 mg/L NAA. Số chồi, số lá và chiều dài chồi thấp nhất được ghi nhận khi BAP tăng từ 0,5 mg/L đến 2,0 mg/L và ở mức 0,5 mg/La. Mặt khác, số lượng rễ tối đa (16,25) và chiều dài rễ (3,92 cm) được đo trên các chồi được tiền xử lý trên môi trường MS bổ sung IBA 1,5 mg/L. Không giống như vậy, chiều dài và số lượng rễ tối thiểu thu được từ IBA 3mg/L. Khả năng sống sót thấp nhất (40%) của cây con được ghi nhận trong quá trình thích nghi trên hỗn hợp đất vườn, cát và phân bò với tỷ lệ 2: 1: 1. Nhìn chung, nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết hợp BAP và NAA ở nồng độ trung bình để khởi đầu phát triển và nhân chồi; IBA ở nồng độ thấp và trung bình cho rễ là môi trường cơ bản tốt nhất để nhân giống đu đủ in vitro từ chồi non. Tuy nhiên, cần các nghiên cứu sâu hơn để giảm thiểu tỷ lệ sống thấp của cây con nhằm nhân giống đại trà và thương mại hóa quy trình phát triển in vitro.
 

Từ khóa: BAP, IBA, NAA, Root Induction, Shoot Bud, Shoot Initiation, Carica Papaya
 

Đu đủ (Carica papaya L.) thuộc họ nhỏ của Caricaceae, trong đó có 35 loài được đặt trong sáu chi. Trong số tất cả các loài có 32 loài đơn tính, hai loài hữu tính và một loài lưỡng tính [1]. Đu đủ là loài duy nhất thuộc chi Carica, cũng là loài được biết đến nhiều nhất và có tính kinh tế quan trọng nhất trong Họ [2]. Theo thực vật học, đu đủ có ba loại giới tính khác nhau: staminate (cây đực) sản xuất hoa staminate, cây cái sản xuất hoa pistillate (cây cái) và cây lưỡng tính sản xuất hoa lưỡng tính [3]. Nó là một loại cây ăn quả quan trọng được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới. Nó hiện đang được trồng rộng rãi trên toàn khu vực nhiệt đới và ở những vùng ấm nhất của cận nhiệt đới và những nơi khác trong khu vực Đông Nam Á [4]. Ngày nay nó cũng được trồng phổ biến ở Ethiopia như là nguồn cung cấp sắt, canxi, vitamin A, B, C [5-6] và nhựa cũng là một nguồn enzyme phân giải protein hiệu quả gồm papain và chymopapain.
 

Nó có thể được nhân giống hữu tính bằng cách sử dụng hạt giống và vô tính thông qua ghép và cắt rễ. Tuy nhiên, trở ngại của nhân giống bằng hạt là việc nguồn giống không giống hoàn toàn cây mẹ do sự tách biệt các con giống ở kiểu giới tính thế hệ thứ hai; tính dị hợp tử vốn có và tính chất dioecious của cây; và hạt của hoa thụ phấn mở thể hiện sự thay đổi đáng kể về hình dạng, kích thước, hương vị và dễ nhiễm bệnh [7]. Tương tự như vậy tái sinh vô tính cũng thường chậm và không thực tế khi thực hiện trên quy mô lớn. Do đó để giảm thiểu những vấn đề này, việc vi nhân giống hiệu quả cây đu đủ trở nên quan trọng đối với việc nhân giống các kiểu giới tính đặc biệt ở cây đu đủ [8] và trong ứng dụng công nghệ biến đổi di truyền. Do đó, việc nhân giống và trồng đu đủ bị giới hạn bởi các kỹ thuật thông thường ở Ethiopia và không có nghiên cứu nào được tiến hành trong quá trình nhân giống in vitro cây đu đủ, nghiên cứu này được tiến hành để lấp đầy khoảng cách này bằng cách phát triển một quy trình nhân giống hiệu quả và tái sinh khi nuôi cấy búp chồi đu đủ (Carica papaya L.).
 

Nghiên cứu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật của Phòng CNSH thực vật tại Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Mekelle (MARC), Bắc Ethiopia trong giai đoạn 2012/13.

Chuẩn bị nguyên liệu thực vật: Các mẫu là búp chồi thu từ cây Carica papaya L. cv. Maradol gieo hạt lưỡng tính ba tháng tuổi được trồng trong nhà kính. Búp chồi đu đủ được rửa sạch dưới vòi nước chảy và sau đó được xử lý bằng 3 giọt tween-80 lắc liên tục trong khoảng 7 phút. Sau đó các mẫu được chuyển vào tủ cấy và được đặt vào bình tiệt trùng. Sau đó, các mẫu ngập trong 0,1% HgCl2 và lắc nhẹ để khử trùng thêm trong 5 phút. Các mẫu đã được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5 lần để loại bỏ chất khử trùng. Sau khi khử trùng, các lá bên ngoài đã được loại bỏ và chồi non dài 3 cm đã được tách và chuẩn bị để cấy.
 

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thiết lập nuôi cấy: Môi trường Murashige và Skoog được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm bao gồm các chất khoáng đa và vi lượng cơ bản và các chất bổ sung các chất  hữu cơ. Trong tất cả các trường hợp, dung dịch gốc MS [9] được bổ sung 30 mg/L sucrose làm nguồn cacbon, sử dụng 8 mg/L agar. BAP (0; 0,5; 1,0;1,5 và 2,0 mg/L) kết hợp với nồng độ NAA phù hợp (0,5 mg/L) được chuẩn bị để khởi đầu phát triển và nhân chồi. pH được điều chỉnh đến 5,8 bằng cách thêm  HCl 0,1% và NaOH 0,1% theo yêu cầu. Môi trường cơ bản sau đó được đổ vào các bình nuôi cấy Magenta và môi trường được hấp ở 15 pound mỗi inch vuông (psi) và 121°C trong 20 phút. Cuối cùng, tất cả các môi trường nuôi cấy đã được khử trùng được làm nguội ở nhiệt độ phòng và được bảo quản trong phòng nuôi cấy cho đến khi sử dụng tiếp.
 

Các bề mặt được tiệt trùng, mẫu được tỉa và nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy chồi gồm MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) và BAP ở (0; 0,5; 1,0;1,5 và 2,0 mg/L) kết hợp với NAA ở nồng độ 0.5 mg/L. Bình nuôi cấy được niêm phong bằng parafilm và giữ trong phòng sinh trưởng dưới chu kỳ sáng 16: 8 h (sáng: tối) với cường độ ánh sáng 2000-2500 lux ở 25 ± 2°C và độ ẩm tương đối 70% (RH). Cấy chuyền được thực hiện bằng cách chuyển các cây con mới vào môi trường nuôi cấy mới trong khoảng thời gian 2 tuần. Tốc độ tăng trưởng của chồi (số ngày khởi đầu ra chồi, số lượng lá, số chồi và chiều dài chồi) được ghi nhận mỗi tuần.
 

Tạo rễ từ chồi: Các chồi có chiều cao hơn 1,0 đến 1,8 cm được lấy ra khỏi bình và sau đó được đặt vào môi trường ½ MS bổ sung (0; 0,75; 1,5; 2,25 và 3 /mg/L) nồng độ IBA. pH đã được điều chỉnh đến 5,8 với NaOH 0,1% N và 0,1% N HCl trước khi hấp ở 121°C và 15 pounds mỗi inch vuông (psi) trong 20 phút. Phòng nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ đồng nhất 25 ± 2°C được cung cấp bằng đèn ống huỳnh quang 2000-2500 lux ở 25 ± 2°C và độ ẩm tương đối 70% (RH) trong chu kỳ sáng/tối:16/8 giờ. Số lượng rễ và chiều dài rễ được đo sau một tháng nuôi cấy.
 

Thuần dưỡng: Cây đu đủ con được lấy ra từ các lọ thủy tinh và rửa sạch dưới nước máy chảy nhẹ nhàng để loại bỏ thạch. Các cây con có rễ phát triển khỏe mạnh được trồng trong chậu có đất than bùn dừa. Sau bốn ngày trong đất than bùn dừa, các cây con được chuyển đến các chậu nhựa chứa hỗn hợp đất vườn, phân bò và cát với tỷ lệ 2: 1: 1 và được phủ bằng polyethylene để giữ độ ẩm cao. Cây con được phủ bằng tấm nhựa và để trong nhà kính bóng râm trong một tháng. Cuối cùng, khả năng sống sót của cây con được ghi lại.
 

Kết quả và thảo luận
 

Sự hình thành và tăng sinh chồi từ búp [H1]: Như đã chỉ ra trong T (1), có sự khác biệt đáng kể (p <0,01) giữa khi kết hợp của nồng độ cytokinin (BAP) và auxin (NAA) vào số ngày xuất hiện chồi, số lượng lá chồi, cũng như chiều dài chồi. Tuy nhiên; BAP ở mức 0,5; 1,0 và 1,5 mg/L không khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhau. Việc hình thành nhanh nhất được ghi nhận trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA; nơi chồi được nhân trong vòng 9,5 ngày kể từ ngày cấy. Trong khi đó, khoảng thời gian dài nhất để bắt đầu hình thành chồi (13,5 ngày) được ghi nhận trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BAP + 0,5 NAA có khác biệt đáng kể so với các nghiệm thức khác. Số ngày bắt đầu hình thành chồi giảm ở nồng độ hormone  thấp hơn nhưng tăng lên khi nồng độ hormone tăng lên. Điều này có thể là do tác dụng kết hợp của hormone nội sinh thấp và hormone ngoại sinh thấp hơn để khởi đầu hình thành chồi trong một khoảng thời gian ngắn so với các ảnh hưởng kết hợp của nồng độ hormone ngoại sinh cao hơn với nồng độ hormone nội sinh thấp hơn. Kết quả tương tự với các kết quả thu được bởi Hidaka và cộng sự và Kabir và cộng sự [10, 11].
 

Sự hình thành nhiều lá trong tất cả các nghiệm thức cho thấy, số lượng lá tối đa (21) được đếm từ môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA. Trong khi số lượng lá tối thiểu (17) được đếm trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/L BAP + 0,5 NAA mg/L cho khác biệt đáng kể so với các nghiệm thức khác. Các lá được hình thành trên môi trường MS có chứa 2,0 mg/L BAP và nồng độ 0,5 mg/L có màu nhạt với các gân chính nổi và quan sát thấy một số lá hình dáng bất thường. Điều này có thể là do các triệu chứng ngộ độc BAP trên sự hình thành lá ở nồng độ cao hơn. Ngược lại, cây trên các môi trường khác có lá màu xanh đậm với chất lượng chồi tốt. Drew [12]  báo cáo tương tự về hình thái lá của các chồi đu đủ trong ống nghiệm.
 

Nồng độ BAP khác nhau những ảnh hưởng kết hợp của cùng nồng độ NAA tương tự cho thấy ảnh hưởng đáng kể đến số lượng chồi. Phát hiện này phù hợp với Reuvani và cộng sự, Davis và cộng sự và Drew và cộng sự, [13-15]. Số lượng chồi cao nhất (16) được tính trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA. Tuy nhiên, số chồi thấp nhất (9.5) là từ môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BAP + 2 mg/L NAA khác biệt đáng kể so với các nghiệm thức khác (Bảng 1). Các nghiên cứu tương tự được thực hiện bởi Hidka và cộng sự, Hossainet và cộng sự, Islam và cộng sự và Panjaitan và cộng sự, [11; 16-19]. Số lượng chồi tạo ra giảm khi nồng độ BAP tăng từ 1,0 mg/L đến 2,0 mg/L và giảm ở 0,5 mg/L. Sự khác biệt về số chồi có thể liên quan đến các tác dụng sinh lý và ức chế của các cytokinin sinh tổng hợp của BAP ở nồng độ cao [20-21].
 

Chồi dài nhất (1,7cm) được đo trên môi trường MS bổ sung với BAP 1,0 mg/L + 0,5 mg/L NAA và ngắn nhất (1,12cm) được ghi trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BAP + 2,0 mg/L NAA. Khi nồng độ BAP tăng từ thấp đến cao, chiều dài trung bình của chồi giảm đáng kể. Berrie [20] cũng mô tả rằng nồng độ cao hơn nồng độ nồng độ cytokinine tối ưu thì ức chế sự tăng trưởng của chồi. Mặt khác, ở nồng độ BAP thấp hơn chiều dài trung bình của chồi giảm; điều này có thể là do nồng độ cytokinine thấp hơn làm tác dụng kéo dài chồi thấp hơn. Điều này phù hợp với Islam và cộng sự, [17].
 

Tạo rễ của chồi: Trong số 5 nghiệm thức, số rễ tối đa (16,25) và rễ tốt nhất thu được từ 1,5 mg/L IBA và với nhiều nhánh (Bảng 2). Số rễ ít nhất (9,00 và 7,75) được hiển thị trên môi trường có chứa IBA nồng độ 2,25 mg/L và 3,0 mg/L. Điều này là do sự hình thành của callus ở gốc rễ và cũng có thể là những tác động độc hại của IBA ở nồng độ cao hơn. Phát hiện tương tự đã được báo cáo bởi Mousumi [22]. Kết quả khẳng định rằng, sử dụng nồng độ IBA tương đối thấp (1,5 mg/L) cho phép mẫu chồi hình thành rễ ở số lượng lớn nhất; do đó, những điều kiện này được khuyến khích cho sự hình thành rễ tối ưu. Những kết quả này phù hợp với Anandan và cộng sự, Rogayah và cộng sự và Rohman và cộng sự, [21: 23-24].
 

Nghiệm thức cho chiều dài rễ tốt nhất (3,92 cm) được tìm thấy trên môi trường MS bổ sung với nồng độ 1,5 mg/L IBA (Bảng 2). Rễ ngắn nhất (2,25 cm) được ghi nhận trên môi trường có IBA 3,0 mg/L. Tăng nồng độ IBA thúc đẩy chiều dài rễ lên đến mức nhất định và hơn nữa gây tác động ức chế lên chiều dài rễ [25]; [7]. Không có biến dị nào được quan sát thấy trên môi trường MS chứa IBA nồng độ 0,75 mg/L và 1,5 mg/L với chiều dài rễ trung bình tương ứng 3,72 và 3,92 cm.
 

Thuần dưỡng: Tỷ lệ sống thấp nhất được ghi nhận từ các cây con được chuyển vào nhà kính và được trồng trong các chậu nhựa có chứa đất vườn, cát và phân bò với tỉ lệ 2: 1: 1 (Bảng 3). Do đó, chỉ có 40% cây con được thuần dưỡng sống sót trong nhà kính. Điều này là do hiệu ứng của nhà kính, nhiệt độ không được điều chỉnh tốt, độ ẩm tương đối và mức cường độ ánh sáng. Tương tự như vậy, một số cây con còn sống sót cũng cho thấy các triệu chứng hoại tử lá. Mặt khác, tổn thương rễ trong quá trình chuyển, cấy và nhổ rễ từ môi trường cũng là một yếu tố khác làm cây con có tỷ lệ sống sót thấp nhất. Kết quả tương tự cũng được thu thập bởi Kabir và cộng sự, Islam và cộng sự và Anandan và cộng sự, [11: 17: 21].
 

Nhìn chung, kết luận được rằng, các quy trình in vitro được mô tả trong nghiên cứu này để nhân giống vô tính Carica papaya cv. L.Maradol, sử dụng búp chồi khá đơn giản, có thể tái sinh và vi nhân giống và tạo rễ cho các chồi in vitro đạt được thành công; mặc dù, một nửa số cây con thuần dưỡng không thể sống. Vì vậy, mục tiêu dài hạn và nỗ lực hướng tới cải thiện phản ứng của Carica papaya L. với thao tác in vitro nên được tiếp tục tiến hành.

 

Bảng 1: Ảnh hưởng của các nồng độ BAP khác nhau lên phản ứng hình thái học khác nhau của Carica papaya L.

Các giá trị có chữ cái giống nhau trong cùng một cột không có sự khác biệt ý nghĩa ở 1%, CV = Coefficient of Variation – Hệ số biến thiên (%), n=số, cm= centimeter, LSD=Least Significant Difference –Khác biệt có nghĩa ít nhất

Bảng 2: Ảnh hưởng của các nồng độ IBA khác nhau lên sự hình thành rễ ở vi chồi phát triển in vitro của Carica papaya L.

Giá trị các nghiệm thức trong cột theo sau bởi các giá trị giống nhau không có khác biệt có nghĩa ở 1%. n=số, CV = Coefficient of Variation – Hệ số biến thiên (%),cm= centimeter, LSD=Least Significant Difference –Khác biệt có nghĩa ít nhất
 

Bảng 3 Phần trăm cây sống sau khi chuyển ra vườn

1. Ming, R., Q. Yu and P.H. Moore, 2007.Sex determination in papaya. Seminars in Cell and Developmental Biology, 18: 401-408.

2. Van Droogenbroeck, B., P. Breyne, P. Goetghebeur, E. Romeijn-Peeters, T. Kydnt and G. Gheysen, 2002. AFLP analysis of the genetic relationships among papaya and its wild relatives (Caricaceae) from Ecuador. Theoretical and Applied Genetics, 105: 289-297.

3. Bruce, S. and C.A. Peter, 2008. Handbook of Environmental Physiology of Fruit Crops. 1 Ed. St pp: 217.

4. Jennylynd, B. and J.T. Ngarmsak, 2010. Processing of fresh-cut tropical fruits and vegetables: A technical guide.Food and Agriculture Organization of the United Nations Regional Office for Asia and the Pacific Bangkok.

5. Samson, J.A., 1986. Tropical Fruits. (2 edition). Nd Longman Scientific and Technical, pp: 256-269.

6. USDA, (United States Department of Agriculture), 2009. National nutrient data base for standard refence, release 22, nutrient data laboratory homepage, http://www.ars.usda.gov/ba/bhnrc/ndl. Accessed on December10, 2012.

7. Saker, M.M., S.A. Bekheet, H.S. Taha and A.A. Reda, 1999.In vitropropagation of papaya (CaricapapayaL.) www. acgssr.org/ Biotechnology/V2N2December1999/fullpaper/p22. Accessed on February19, 2013.

8. Lai, C.C., S.D. Yeh and J.S. Yang, 2000. Enhancement of papaya axillary shoots proliferation in vitroby controlling the available ethylene. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 41: 203-212

9. Murashige, T. and F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiolology Plantarum, 15: 473-497.

10. Hidaka, T., S. Komori, M. Yamada and H. Fukamachi, 2008. Mass production of papaya (Carica papayaL.) saplings using shoot tip culture for commercial use. South Pacific Studies, 28: 2.

11. Kabir, A.H., M.A. Bari, A.K.M.N. Hunda, M.A. Rezvy and I. Mahfuz, 2007. Effects of growth regulators and carbon source on axillary shoot proliferation from shoot tip explant and successful transplantation of papaya (Carica papaya  L.). Biotechnology, 6(2): 268-272.

12. Drew, R.A. 1992. Factors affecting growth re-sponses to fructose  and  other  sugars,  p:.  65-82.  In:  Tissue culture and field evaluation of papaya (Carica papaya L.).  PhD  Diss.,  Murdoch  Univ., Murdoch, Western Australia.

13. Reuveni, O., D.R. Shlesinger and U. Lavi, 1990. In vitroclonal propagation of dioecious Carica papaya. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 20:41-46. Netherlands: Kluwer Academic Publisher.

14. Davies, P.J., 1987. Plant hormones and their role. In: Davies, P. and J. Dordrecht (eds.). Plant Growth and Development, pp: 1-11. The Netherlands, Martinus Nijhoff.

15. Drew, R.A., 1988. Rapid clonal propagation of papaya in vitrofrom mature field grown trees. Hort Science, 23: 609-611

16. Hossain, M., S.M. Rahman, R. Islam and O.I. Joarder, 1991. High efficiency plant regeneration from petiole explants of Carica papaya L.  through organogenesis. Plant Cell Report, 13: 99-102.

17. Islam, R., S.M., Rahman, M. Hossain and O.L. Joarder, 1993.In vitropropagation of papaya through culture of lateral buds from mature field grown plants. Plant Tissue Culture, 3: 47-50.

18. Islam, M., 2001. In vitro plant regeneration and improvement of Carica papaya L.  Through somaclonal variation. PhD Thesis. Plant Breeding and Biotechnology Laboratory, Department of Botany, University of Rajshahi, Bangladish.

19. Panjaitan, S.B., M.A. Aziz, A.A. Rashid and N.M. Saleh, 2007. In vitroPlantlet Regeneration from shoot  tip  of  field-grown  hermaphrodite  papaya (Carica papaya L.). International Journal of Agriculture and Biology, 6: 827-832.

20. Berrie, A.M., 1984. Germination and growth regulators. In: Advanced plant physiology. Malcom, W.B. (ed.), English Language Book Society. Long man, pp: 987

21. Anandan, R., S. Thirugnanakumar D. Sudhakar and

Murdoch, Western Australia. P. Balasubramanian, 2011.In vitro organogenesis and  plantlet  regeneration  of  (Carica papayaL.). Journal of Agricultural Technology, 7(5): 1339-1348

22. Mousumi, M., G. Sukumar and M.B. Barid, 1994. Callus  culture  and  plantlet  production  in Carica papaya(Var. Honey Dew). Plant Cell Reports, 13: 390-393.

23. Rogayah, S., J.O. Abdullah, P. Namasivayam, Martinus Nijhoff. P. Muda and U.K.A. Bakar, 2012. Better rooting procedures to enhance survival rate of field grown Malaysian Eksotika papaya transformed with 1-Aminocyclopropane-1carboxylic acid Oxidase Gene.  Improvement  Science  Research  Network Biotechnology, pp: 1-10.

24. Rohman, M.M., Md.N. Islam, Md.S. Alam, M.R. Ahmad and K. Paul, 2007. Lateral bud culture of papaya (Carica papayaL.) for clonal propagation. Biotechnology, 6(3): 339-343, Japan.

25. Protul, K.R., K.R. Shyamal and M.D.H. Lokman, 2012. Propagation  of  papaya  (Carica papayaL.) CV. SHAHI through in vitro culture. Bangladesh Journal of Botany, 41(2): 191-195.

Trâm Anh
SBC Scientific