Tóm tắt:
 

   Mục đích của nghiên cứu này là phát triển một phương pháp nhân giống in vitro cho Macadamia (Macadamia integrifolia). Việc thiếu các chương trình chăn nuôi và các chiến lược nhân giống để tạo cây có những đặc tính nông học tốt sẽ hạn chế sản xuất thương mại Macadamia. Sự nhân giống của dòng thông qua nuôi cấy mô in vitro là một công nghệ đầy hứa hẹn để nhân giống cây với các đặc tính di truyền mong muốn. Trong nghiên cứu này, các môi trường cơ bản khác nhau và các chất điều chỉnh tăng trưởng đã được thử nghiệm để thiết lập một quy trình cho việc nhân giống Macadamia in vitro. Số lượng chồi cao nhất (lên đến sáu) mỗi mẫu đạt được bằng cách nuôi đốt cành lấy trên cây một năm tuổi từ nhà kính. Các mẫu được nuôi trên Woody Plant Medium (WPM) bổ sung với BAP (2 mg/l) và IBA (1 mg/l) trong 8 tuần. WPM được sử dụng để kéo dài chồi. Việc tạo rễ từ chồi đã được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên WPM với IBA (2 mg/l) trong hai tuần đầu và sau đó chuyển sang WPM trong sáu tuần sử dụng các bình nuôi bằng nắp đậy. Cây Macadamia in vitro đã được trồng thành công trong đất ở điều kiện nhà kính.
 

Giới thiệu:
 

   Macadamia, một cây thân gỗ có hạt thuộc họ Proteaceae. Chi này gồm chín loài, nhưng chỉ có Macadamia tetraphylla và M. integrifolia có tầm quan trọng kinh tế. Hạt Macadamia được sử dụng chủ yếu trong các ngành công nghiệp bánh kẹo và mỹ phẩm. Macadamia có nguồn gốc từ Úc và đã được giới thiệu đến các nước khác bao gồm Nam Phi, Kenya, Malawi, Zimbabwe, Guatemala, Brazil, Costa Rica, Mexico, Fiji và Hoa Kỳ (Gitonga và cộng sự, 2008). Ở Mỹ, hạt macadamia được sản xuất chủ yếu ở Hawaii, Florida và California (Gitonga và cộng sự, 2008, Cha-um và cộng sự, 2011).
 

   Cây Macadamia được nhân giống qua hạt. Tuy nhiên, các phương pháp như ghép và nhân giống in vitro macadamia được ứng dụng tốt hơn để tạo điều kiện cho sự phát triển của cây, làm giảm mức độ cao của bệnh heterozygosis của hạt, thúc đẩy các chương trình nhân giống, và để sản xuất hạt ở quy mô lớn. Việc trái thiếu chất lượng là trở ngại chính cho việc sản xuất và thương mại hoá hạt macadamia. Để đáp ứng nhu cầu hạt của tương lai, các công nghệ hiện đại như công nghệ sinh học và lai phân tử (molecular breeding) nên được sử dụng. Những công nghệ tiên tiến này đòi hỏi phải thiết lập hệ thống tái tạo in vitro hiệu quả và các hệ thống tái tạo thực vật. Nghiên cứu này mô tả sự phát triển của việc nhân giống dòng vô tính của Macadamia integrifolia.
 

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
 

1. Khử trùng mô cấy:
 

Cành non của cây một năm tuổi trồng trong nhà kính đã được lựa chọn để cắt chồi và các đốt thân (Hình 1A-C). Trong một tháng trước khi tách mẫu, các cây đã được phun các loại thuốc diệt nấm và vi khuẩn khác nhau để kiểm soát sự nhiễm của nấm và vi khuẩn. Các mẫu được khử trùng với thuốc tẩy thương mại 25% (5.25% sodium hypochlorite) với một vài giọt Tween-20 trong 20 phút, và sau đó rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng. Các mẫu khử trùng được thấm sạch trên khăn giấy vô trùng trước khi nuôi cấy in vitro.
 

2. Tạo chồi, kéo dài chồi và tạo rễ:
 

Các chồi đỉnh và các đốt thân (chiều dài ~ 2 cm) được nuôi cấy trước tiên vào môi trường cảm ứng chồi khác nhau, bao gồm MS và WPM (Murashige và Skoog, 1962, Lloyd, G. và McCown, BH 1981, Gitonga, và các cộng sự, 2008 , 2009, 2010) bổ sung với BAP, NAA, IBA, và/hoặc GA (Bảng 1, Hình 1). Sau khoảng 4 tuần, phát triển chồi (chiều dài khoảng 2 cm) được cắt và chuyển sang môi trường kéo dài (Bảng 2). Sáu đến 8 tuần sau, chồi dài khoảng 5 cm được chuyển sang môi trường tạo rễ (Bảng 3). Rễ các cây con đã được tạo thành trong đất (Hình 1). Macadamia cần một loại đất chứa chất hữu cơ có độ pH 6.0. Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng và tăng trưởng tối ưu và quang hợp xảy ra trong khoảng hẹp 20-25°C.
 

Bảng 1. Hiệu quả của môi trường tái sinh khác nhau lên việc hình thành chồi nách
 

Thành phần môi trường	Số chồi/mẫu
½ MS	2
WPM	3
½ MS + 2 mg/L BAP + 1mg/L IBA	4
WPM + 2 mg/L BAP + 1 mg/L IBA	6
½ MS + 0.5 mg/L BAP + 0.2 mg/L NAA	2
½ MS + 0.5 mg/L BAP + 1 mg/L NAA	2
½ MS + 0.05 mg/L BAP + 0.02 mg/L NAA + 0.04 mg/L GA3	1
½ MS + 0.05 mg/L IBA	0

 

Bảng 2. Hiệu quả của môi trường nuôi cấy lên sự kéo dài rễ
 

Thành phần môi trường	Sự kéo dài chồi (%)
½ MS *	0
WPM	70
MS	50
½ MS + 1 mg/L GA3	50
WPM + 1 mg/L GA3	50

½ MS*= nửa nồng độ muối MS cơ bản 

Bảng 3. Hiệu quả của môi trường nuôi cấy lên sự tạo rễ
 

Thành phần môi trường	Sự tạo rễ (%)
WPM + 2mg/L IBA (2 tuần), WPM (6 tuần)	60
½ MS* + 2mg/L IBA	10
½ MS	0
WPM	40

 

Hình 1. Mốc thời gian cho nhân giống in vitro của  Macadamia integrifolia

Hình 2. Các bước trong nhân giống in vitro của Macadamia integrifolia

Kết quả và thảo luận
 

Việc tái tạo và nhân giống in vitro của macademia từ các mô khác nhau đã được thực hiện thông qua sự hình thành cơ quan và sự phát triển của phôi (Mulwa và Bhalla 2000, Bhalla và Mulwa 2003, Mulwa và Bhalla 2006, Gitonga và cộng sự, 2008). Tuy nhiên, các rào cản lớn cho việc nhân giống Macadamia in vitro vẫn tồn tại do hoại tử chồi, thủy tinh thể (vitrification) và sự hình thành callus trong tất cả các giai đoạn nuôi cấy (Cha-um và cộng sự, 2011). Trong công trình này, một phương pháp hiệu quả sử dụng các đốt thân được thiết lập để nhân giống macadamia trong khoảng 6 tháng (Hình 1 và 2). Số lượng chồi lớn nhất lên đến 6 ngọn/mẫu được cấy trên môi trường WPM bổ sung BAP (2mg/l) và IBA (1mg/l) (Hình 1 và Bảng 1). Một khi các chồi được tạo ra, hơn 50% trong số chúng tiếp tục tăng trưởng trong hầu hết các môi trường kéo dài được thử nghiệm (Bảng 2). Hơn 60% số chồi bắt đầu tạo rễ trong vòng 4 tuần sau khi chuyển sang môi trường tạo rễ. Sự kích thích của rễ tốt nhất khi các chồi dài được giữ hai tuần trong WPM bổ sung IBA (2mg/l) và sau đó chuyển sang môi trường tương tự mà không có IBA và sucrose (Bảng 3, hình 1 và 2). Để tạo ra rễ, điều quan trọng là sử dụng các bình nuôi cấy thoáng khí để giảm nồng độ ethylene và CO2. Phương pháp của chúng tôi đã giải quyết được những khó khăn bình thường và nghiêm trọng trong báo cáo nghiên cứu khác và có thể tiến hành việc sản xuất các cây macadamia khỏe mạnh và có bộ rễ tốt.
 

Tài liệu tham khảo:
 

Bhalla, PL. and Mulwa, RMS. (2003) Tissue culture and macadamia propagation. Acta Hortic 616:343-346.

Cha-um, S., Chanseetis, Ch., Chintakovid, W., Pichakum, A. (2011) Promoting root induction and growth of in vitro macadamia (Macadamia tetraphylla “Keaau”) plantlets using CO2 –enriched photoautotrophic conditions. Plant Cell Organ Cult. 106: 435-444.

Gitonga, LN., Gichuki, ST., Ngamau, K., Muigai, AWT., Kahangi, EM., Wasilva, LA., Wepukhulu, S., Jogu, N. (2010) Effect of explant type, source and genotype on in vitro shoot regeneration in Macadamia (Macadamia spp.). Agricultural Biotechnology and Sustainable Development. 2(7): 129-135.

Gitonga, L., Kanangi, E., Ngamau, K., Muigai, A., Gichuki, S. (2009) In vitro and in vivo methods of propagation towards ex situ conservation of Macadamia (Macadamia spp.) Germplasm in Kenya. Afr. J. Hort. Sci. 2:1-12.

Gitonga, L., Kanangi, E., Gichuki, S., Ngamau, K., Muigai, A., Njeru, E., Njogu, N., Wepukhulu, S. (2008) Factors influencing in vitro shoot regeneration of Macadamia integrifolia. African Journal of Biotechnology. 7 (22): 4202-4207.

Lloyd, G. and McCown, BH. (1981) Commercially-feasible micropropagation of Mountain Laurel, Kalmia latifolia, by shoot tip culture. Proc. Int Prop. Soc. 30:425-427.

Mulwa, RMS. and Bhalla, PL .(2000) In vitro shoot multiplication of Macadamia tetraphylla L. Johnson. Plant Cell Rep 25:1281-1286.

Mulwa, RMS. and Bhalla PL .(2006) In vitro plant regeneration from inmature cotyledons explants of macadamia (Macadamia tetraphylla L. Johnson). Plant Cell Rep 25:1281-1286.

Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant. 15: 473-497

Lời cảm ơn

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Finca Kassandra , Cordova-Veracruz, Mexico.

Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com