Trong bài viết này sẽ giới thiệu kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật trên cây Lan Kim Tuyến hay còn được gọi với tên gọi khác là Lan Kim Tuyến lông cứng, Kim Tuyến, Kim Tuyến Tơ, Lan Gấm, Cỏ Nhung, Kim Cương hay Giải Thuỷ Tơ. Lan Kim Tuyến có danh pháp khoa học là Anoectochilus setaceus. Các môi trường sử dụng: MS vitamins, Knudson C Orchid, và môi trường SH( SCHENK & HILDEBRANDT BASAL SALT MEDIUM).
Nuôi cấy mô invitro Lan Kim Tuyến
Lan Kim Tuyến được xem là một vị thuốc có tác dụng trị lao phổi, ho phế nhiệt, viêm khí quản, phong thấp, đau nhức khớp xương, đau do chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, gan mãn tính, suy nhược thần kinh; ngoài ra còn giúp tăng cường thể lực, lưu thông khí quyết và có tính kháng khuẩn. Bởi trong thành phần của Lan Kim Tuyến có các hoạt chất như: quercetin, isoharmnetin-3-O-beta-D-glucopyranosid, kaempferol-3-O-beta-D-glucopyranosid, 5-hydroxy-3'-4'-7'-trimethoxyflavonol-3-O-beta-D-rutinosid và isorhamnetin-3-O-beta-D-rutinosid.
Do nhu cầu bùng nổ các loại thuốc có nguồn gốc thực vật nên dẫn đến việc khai thác quá mức, làm đe doạ đến sự tồn vong của các loài cây quý trong đó có Lan Kim Tuyến. Cho đến nay, đã có một số công trình nghiên cứu về nhân giống in vitro trong và ngoài nước trên đối tượng lan này như Shiau et al., (2002); Ket et al., (2003, 2004); Nhut et al., (2006); Phùng Văn Phê và cộng sự (2010); Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Cẩm Miện, 2012; Nguyễn Tuấn Anh và cộng sự (2013).
Quá trình nhân giống Lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật được chia làm 3 bước:
A. Giai khử trùng và vô mẫu:
Lấy đoạn chồi ngâm trong xà phòng 20 phút, rửa bằng nước dưới vòi và đưa vào box cấy. Mẫu cấy tiếp tục được ngâm trong cồn 70 độ trong 30 giây, sau đó tiến hành khử trùng với nuối thuỷ ngân HgCl2 0,1% có nhỏ thêm 3 giọt Tween 20 trong 20 phút, rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần rồi đưa vào môi trường nuôi cấy.
Môi trường ở giai đoạn này ta sử dụng MS( Murashige and Skood medium , 1962); hoặc sử dụng Knudson C Orchid medium. Hầu hết các loại lan cần lượng khoáng rất ít nên ta sử dụng Knudson C, tuy nhiên môi trường MS quá phổ biến nên người ta thường sử dụng để nhân Lan.
B. Giai đoạn nhân nhanh:
Dùng Knudson thường + 0.6mg/L BAP hoặc 1mg/L Kinetin. Tuy nhiên BAP cho kết quả tốt hơn. Cũng có thể dùng 1/2MS vitamins + 0.6mg/L BAP.
C. Giai đoạn tạo rễ:
Trong quá trình tạo chồi cây cũng có rễ rồi nên không cần thiết phải thêm Auxins. Có thể thêm 100ml/L nước dừa cho quá trình kích thích tạo rễ.
Lưu ý:
- Than hoạt tính nên thêm ở mỗi giai đoạn: từ 2-3g/L
- Đường đối với Lan này thì 20g/L. Thông thường sử dụng 30g/L vẫn được.
- pH 5.8
Trong một bài nghiên cứu khác của Tiến Sỹ Dương Tấn Nhựt, sử dụng môi trường SH.
A. Giai đoạn khởi tạo chồi: sử dụng SH + 1mg/L BA hoặc BAP sẽ cho kết quả tốt nhất.
B. gian đoạn sinh trường và phát triển chồi ta sử dụng môi trường SH + 1mg/L BAP + 1mg/L NAA. Việc sử dụng riêng lẻ 1.g/L BAP cũng tạo ra rễ nhưng yếu hơn so với kết hợp NAA. Sự tổng hợp các diệp lục tố giúp sự quang hợp tốt hơn, chồi phát triển nhanh hơn, tăng kích thước và tạo nhiều rễ.
Bảng thành phần môi trường MS vitamins:
|
Thành phần vi lượng |
mg/l |
µM |
|
CoCl2.6H2O |
0.025 |
0.11 |
|
CuSO4.5H2O |
0.025 |
0.1 |
|
FeNaEDTA |
36.7 |
100 |
|
H3BO3 |
6.2 |
100.27 |
|
KI |
0.83 |
5 |
|
MnSO4.H2O |
16.9 |
100 |
|
Na2MoO4.2H2O |
0.25 |
1.03 |
|
ZnSO4.7H2O |
8.6 |
29.91 |
|
Thành phần đa lượng |
mg/l |
mM |
|
CaCl2 |
332.02 |
2.99 |
|
KH2PO4 |
170 |
1.25 |
|
KNO3 |
1900 |
18.79 |
|
MgSO4 |
180.54 |
1.5 |
|
NH4NO3 |
1650 |
20.61 |
|
Vitamins |
mg/l |
µM |
|
Glycine |
2 |
26.64 |
|
myo-Inositol |
100 |
554.94 |
|
Nicotinic acid |
0.5 |
4.06 |
|
Pyridoxine HCl |
0.5 |
2.43 |
|
Thiamine HCl |
0.1 |
0.3 |
Bản thành phần môi trường SH(SCHENK & HILDEBRANDT BASAL SALT MEDIUM)
|
Micro Elements |
mg/l |
|
CoCl2.6H2O |
0.1 |
|
CuSO4.5H2O |
0.2 |
|
FeNaEDTA |
19.8 |
|
H3BO3 |
5 |
|
KI |
1 |
|
MnSO4.H2O |
10 |
|
Na2MoO4.2H2O |
0.1 |
|
ZnSO4.7H2O |
1 |
|
Macro Elements |
mg/l |
|
CaCl2 |
151 |
|
KNO3 |
2500 |
|
MgSO4 |
195.05 |
|
(NH4)H2PO4 |
300 |
|
Vitamins |
mg/l |
|
myo-Inositol |
1000 |
|
Nicotinic acid |
5 |
|
Pyridoxine HCl |
0.5 |
|
Thiamine HCl |
5 |
Môi trường Knudson C Orchid:
|
Vi lượng |
mg/l |
µM |
|
FeSO4.7H2O |
25 |
89.92 |
|
MnSO4.H2O |
5.68 |
33.61 |
|
Đa lượng |
mg/l |
mM |
|
Ca(NO3)2 |
241.3 |
1.43 |
|
KCl |
250 |
3.35 |
|
KH2PO4 |
250 |
1.84 |
|
MgSO4 |
122.15 |
1.02 |
|
NH4NO3 |
500 |
6.25 |
|
(NH4)2SO4 |
500 |
3.78 |
Ref:
ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY LAN GẤM (Anoectochilus setaceus Blume) NUÔI CẤY IN VITRO( Dương Tấn Nhựt, 2015)
The role of different medium and plant hormones on multiple shoots of Jewel orchids (Anoectochilus setaceus Blume) (Nguyen Trung Thanh, 2011)