Trong nuôi cấy mô thực vật, việc loại trừ mầm bệnh như virus, vi khuẩn, nấm mốc là rất quan trọng, ảnh hướng đến sự thành công của thí nghiệm. Nguồn bài viết từ Rolando Lizarraga, Pilar Tovar, Upali ayasinghe, John Dodds Av.La Universidad s/n Lima – Peru.
STDs trình bày những công nghệ phát triển và/hoặc được dùng trong nghiên cứu bởi CIP và cộng tác với những chương trình quốc gia. STDs được viết để cải tiến trong trao đổi thông tin giữa các nhà khoa học và thường xuyên cập nhật để đảm bảo đem đến những tiến bộ và công nghệ mới nhất.
Các nội dung chính trong Nuôi cấy mô để hạn chế mầm bệnh
1. Bản chất của mầm bệnh
2. Liệu pháp nhiệt
3. Hóa trị
4. Khử trùng bề mặt
5. Kháng sinh
6. Tách đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy
7. Maintenance nuôi cấy
8. Phụ lục (chuẩn bị môi trường)
9. Tài liệu tham khảo
Bệnh thực vật, như tuyến trùng, nấm, vi khuẩn và virus có thể lây từ cây bệnh sang cây khỏe. Tuy nhiên, không phải tế bào nào cũng bị nhiễm bệnh, các tế bào đỉnh sinh trưởng là phần không mang mầm bệnh. Nó có thể tái sinh thành cây không mang bệnh nhờ công nghệ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng in vitro và nuôi thành cây khỏe.
Tài liệu này mô tả phương pháp có thể áp dụng để tách mầm bệnh từ vật liệu bị nhiễm bệnh và sản xuất “cây trồng được kiểm tra bệnh” để phân phối toàn cầu và nhân giống trong chương trình hạt giống khoai tây.
1. BẢN CHẤT CỦA MẦM BỆNH
Bệnh thực vật bao gồm tuyến trùng, nấm, vi khuẩn, rikettsia, mycoplasm, virus và viroid. Chúng truyền nhiễm và có thể lây từ cây bệnh sang cây khỏe. Cho đến nay, không có báo cáo nào cho thấy rikettsia trên khoai tây là một mầm bệnh.
Kích thước tương đối của các mầm bệnh này thay đổi rất nhiều. Trong số các mầm bệnh thực vật, tuyến trùng là lớn nhất và có thể được nhìn thấy dễ dàng bằng kính hiển vi soi nổi. Vi rút và viroids là nhỏ nhất và cần một kính hiển vi điện tử để thấy chúng.
Sự xuất hiện của một bệnh không hoàn toàn phụ thuộc vào sự hiện diện của một vật chủ và mầm bệnh. Điều kiện môi trường đặc biệt là độ ẩm và nhiệt độ đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của một căn bệnh. Bệnh có thể được định nghĩa là một kết quả của sự tương tác của vật chủ, mầm bệnh và môi trường. Khái niệm của bệnh được gọi là "tam giác bệnh".
Sự phân bố các mầm bệnh khác nhau trong cây bệnh cũng khác nhau rất nhiều. Pseudomonas solanacearum, virut lá khoai tây và mycoplasma bị hạn chế trong mô mạch của cây. Erwinia carotovora, và virut khoai tây X (PVX), xâm nhập vào các mô thực vật có mạch và không mạch. Không phải tất cả các tế bào trong một cây bị bệnh đều bị nhiễm các mầm bệnh. Các mô phân sinh đỉnh của ngọn và cành của một cây bệnh đôi khi không có virus. Trong một số trường hợp, chẳng hạn như PVX và vi rút rattle thuốc lá trong khoai tây, chỉ có vòm đỉnh và lá nguyên thủy đầu tiên không có virut. Không có lý do chính xác, tuy nhiên, người ta tin rằng một hoặc tất cả các yếu tố sau đây chịu trách nhiệm.
− Hoạt động trao đổi chất mạnh: virus sao chép nhờ tiếp nhận con đường trao đổi chất của vật chủ. Vì hoạt động trao đổi chất quá mạnh ở các tế bào này, virus không thể tiếp nhận sự điều khiển bộ máy sinh tổng hợp của vật chủ.
− Thiếu hệ thống mạch: Vi rút lan nhanh qua hệ thống mạch. Phloem hạn chế vi rút (PLRV) để chúng không thể xâm nhập các mô tế bào do không có quá trình biệt hóa tế bào. Trong vùng mô phân sinh đỉnh này, các virut gây nhiễm các mô không mạch lan truyền từ tế bào sang tế bào qua plasmodesmata. Quá trình này chậm làm cho virus tương đối khó lây nhiễm hoàn toàn vào các tế bào phân chia mạnh.
− Nồng độ auxin cao: Mô phân sinh đỉnh thực vật có nồng độ auxin cao hơn các mô khác. Những loại auxin này được báo cáo là có khả năng ức chế sự phân chia của virus.
Vì các mô phân sinh đỉnh đôi khi không có mầm bệnh, nên có thể khôi phục các cây không bị nhiễm bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và phát triển chúng thành những cây khỏe.
2. LIỆU PHÁP NHIỆT
Liệu pháp nhiệt tại nhiệt độ cao (37oC) không loại bỏ viroid ống thoi khoai tây (PSTV). PSTV bao gồm một sợi RNA đơn, được xoắn dưới dạng siêu lớp. Trong dạng này nó kháng enzyme nucleases. Nhiệt độ tăng cao, để giảm nồng độ của viroid lại làm tăng hệ số nhân (Sanger và Ramm 1975). Vì vậy, kiểm tra đầu tiên cho PSTV nên được thực hiện vào cuối quá trình liệu pháp nhiệt.
Một phương pháp cho phép tiêu diệt PSTV (Lizarraga và cộng sự, 1980) dựa trên quan sát cây trồng ở nhiệt độ thấp, nồng độ viroid thấp. Trong thí nghiệm, cây trồng đã được trồng ở 8oC trong 4 tháng. Sau đó các vòm đỉnh đã được cắt bỏ. 30% số cây con được tái sinh không có màng tế bào PSTV, ngay cả trong thế hệ củ thứ hai. Mối quan hệ rõ ràng (tiêu cực) giữa kích thước mẫu đỉnh sinh trưởng và gia tăng khả năng thành công đã được ghi nhận (Lizarraga và cộng sự, 1982).
Tuy nhiên phương pháp này không phù hợp để thành một kỹ thuật thông thường, vì mất thời gian và tốn kém. Nó có thể hữu ích trong những trường hợp cụ thể ví dụ một dòng có giá trị bị nhiễm và không có sẵn vật liệu.
Các thí nghiệm được tiến hành với các hệ thống vật chủ khác nhau cho thấy việc xử lý cây trồng với nhiệt độ cao (liệu pháp nhiệt) dẫn đến giảm nồng độ virus trong cây (Kassanis 1957, Quak 1977). Các lý do khác nhau đã được đưa ra để giải thích hiện tượng này; có thể không đơn lẻ, nhưng sự kết hợp của nhiều cách có thể là nguyên nhân làm giảm nồng độ virus. Có thể bao gồm cạnh tranh tổng hợp axit nucleic và protein giữa sự phân chia mạnh của tế bào vật chủ và virus, điều này có thể dẫn đến sự thay đổi sự cân bằng giữa tổng hợp và sự suy thoái của virus. Ngoài ra axit nucleic của virus, chất mang thông tin di truyền của nó, thường được bảo vệ khỏi sự tấn công bởi enzym phân giải nhờ một lớp bao quanh, tạo thành nhiều tiểu đơn protein. Ở nhiệt độ cao, sự liên kết giữa các tiểu đơn vị này trở nên yếu hơn, các lỗ hổng có thể mở ra tạm thời và cho phép sự tấn công lên hạt nhân, dẫn tới việc bất hoạt của virus và giảm nồng độ của virus.
Liệu pháp nhiệt đã được áp dụng cho củ khoai lang cho thấy sự giảm nồng độ virus, chủ yếu là virus lá khoai tây (PLRV). Tuy nhiên, không loại bỏ hết virus được trừ PLRV.
Phương pháp trị liệu nhiệt áp cho toàn bộ cây cũng tốt như chồi từ củ và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thành công để hạn chế virus trên khoai tây (Stace-Smith và Mellor 1970, Pennazio và Redulfi 1973).
Trong quy trình chuẩn, kết quả tốt nhất đã đạt được khi cây bị loại ngọn trước khi đưa vào liệu pháp nhiệt và chồi nách lớn trong quá trình xử lý nhiệt. Chế độ nhiệt độ hàng ngày 36°C trong 10 giờ và 30°C trong 8 giờ và ánh sáng liên tục cường độ cao (10.000 lux) cải thiện tỷ lệ loại bỏ virus. Cây được giữ ở điều kiện này trong 4 tuần. Từ nụ nách, đỉnh sinh trưởng chồi được tách ra và nuôi cấy, thể hiện ở Phần 6.
3. HÓA TRỊ
Là một phương pháp thay thế cho liệu pháp nhiệt, hóa trị đã được thử trong khoai tây. Một chất tương tự nucleoside, Virazole, thường được biết có thể chống lại DNA động vật và RNA virus đã cho các kết quả khác nhau khi áp dụng cho cây khoai tây như phun hoặc nuôi cấy thủy canh, tiếp theo là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Kết quả sơ bộ cho thấy khả thi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng với sự hiện diện của 100 ppm Virazole trong môi trường.
Tuy nhiên, một số báo cáo chỉ ra rằng các hóa chất kháng virut có thể gây đột biến cây trồng. Do đó, hiện nay, liệu pháp nhiệt chắc chắn là phương pháp được ưu tiên sử dụng trước khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
4. KHỬ TRÙNG BỀ MẶT
Nếu bề mặt vật liệu thực vật bị nhiễm bởi các mầm bệnh hoặc saprophytes, các tác nhân đó nhanh chóng phát triển và gây chết thực vật. Hầu hết tác nhân gây nhiễm bề mặt, chẳng hạn như vi khuẩn và nấm, có thể được loại trừ bằng cách tẩy trùng bề mặt vật liệu thực vật bằng chất khử trùng phù hợp.
Các chất khử trùng bề mặt thường được dùng trong 10 đến 15 phút. Ở điều kiện vô trùng, dung dịch khử trùng sau đó được bỏ và vật liệu thực vật được rửa 3 hoặc 4 lần, 5 phút mỗi lần bằng cách lắc trong nước cất vô trùng. Rửa nước cất rất quan trọng để loại bỏ các chất khử trùng vượt trội vốn ức chế sự phát triển của cây trồng.
Ethanol (cồn). Cồn là một chất khử trùng bề mặt phổ biến để diệt vi khuẩn và nấm, và thường được rửa trước khi áp dụng các phương pháp khử trùng bề mặt khác. Nó có độ căng bề mặt thấp và có thể dễ dàng thâm nhập giữa các sợi lông của lá và làm ướt bề mặt.
Natri hoặc canxi hypochlorit. Vật liệu thực vật cũng có thể được khử trùng bề mặt bằng dung dịch lỏng của natri hypochlorite (NaOCl) hoặc calcium hypochlorite (Ca [OCI]2). Muối canxi được ưa chuộng hơn vì nó ít gây độc cho thực vật. Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng chất tẩy gia dụng như Clorox. Các sản phẩm thương mại này thường chứa 5,25% hoạt chất NaOCl. Khi pha loãng với nước (1 phần chất tẩy: 9 phần nước), dung dịch khử trùng cuối cùng có thể chứa ít nhất 0,5% NaOCl.
Do sự phân tách hoàn toàn, hypochlorite có hoạt động tương đối ít ở pH trên 8,0 và hiệu quả hơn khi đệm dung dịch ở khoảng pH 6,0.
Các mô được cắt ra, nhúng vào dung dịch hypochlorite, tiếp xúc 10-15 phút để khử trùng bề mặt. Sau khi xử lý hypochlorit, vật liệu cây trồng được rửa kỹ với nước cất vô trùng để loại bỏ hoàn toàn chất khử trùng.
Mercuric Cloride. Mercuric Cloride (HgCl2) đã được sử dụng như một chất khử trùng, mặc dù cực kỳ độc. Dung dịch clorua thủy ngân dễ bay hơi ở nhiệt độ phòng và có thể gây ngộ độc thủy ngân. Do đó, CHÚNG TÔI KHÔNG KHUYẾN KHÍCH SỬ DỤNG NÓ NHƯ MỘT CHẤT KHỬ TRÙNG!
Thuốc diệt khuẩn và thuốc diệt nấm. Với vật liệu bị nhiễm nặng, một số nhà nghiên cứu khuyên bạn nên rửa trong hỗn hợp thuốc diệt khuẩn/thuốc diệt nấm thương mại trước khi khử trùng bề mặt. Nên nhớ rằng cách này không ảnh hưởng đến hệ thống nhiễm trùng. Phần 3 đưa ra danh sách các chất diệt khuẩn và thuốc diệt nấm cùng với thông tin về việc sử dụng chúng.
5. KHÁNG SINH
Mặc dù thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật để ngăn nhiễm khuẩn, kháng sinh vẫn chưa được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy tế bào thực vật. Các nhà thực vật học sớm đã biết rằng những sản phẩm tự nhiên này có thể làm thay đổi sự phát triển của các mô tế bào thực vật in vitro (Gautheret, 1959, Butenko, 1964). Trên thực tế, các mô thực vật nhạy cảm với kháng sinh và cho thấy các phản ứng biến đổi theo kiểu gen của chúng.
Hầu hết các chuyên gia nuôi cấy mô không dùng kháng sinh để loại bỏ các tác nhân nhiễm trên bề mặt mẫu. Thuốc tốn chi phí và không có hiệu quả chống lại tất cả các loại vi khuẩn gây bệnh . Thuốc kháng sinh chỉ được sử dụng khi các vi sinh vật khó loại bỏ bằng các cách khác.
Các kháng sinh hoặc tổ hợp kháng sinh đã được áp dụng thành công:
- Gentamycin
- Rifampicin
- Nystatin + Carbenecillin
- Gentamycin + Amphotericin B
- Vancomycin-HCI + Mvcostatin
- Streptomycin + Carbenecillin
Các báo cáo về độc tính trong nuôi cấy gây ra bởi:
- Penicillin
- Streptomycin
- Bactericin
- Sparsomycin
6. TÁCH VÀ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
Điểm phát triển mạnh nhất của chồi thực vật là đỉnh sinh trưởng. Đây là một khu vực nhỏ bao gồm các tế bào phân chia nhanh (meristematic).
Vòm của một đỉnh sinh trưởng chồi bao gồm các tế bào đỉnh sinh trưởng và được bao quanh bởi lá sơ khởi và lá sơ cấp. Vì các mô mạch có nhiều sự khác biệt được tìm thấy ở mô phân sinh xa hơn (đối với các mô cũ hơn ở thân), các mạch của lá nguyên thủy vẫn mới bắt đầu, và vẫn chưa tiếp xúc với strana chính của hệ thống mạch trong thân. Do đó, virus có trong hệ thống mạch có thể đến vùng sinh trưởng của đỉnh qua con đường di chuyển giữa tế bào với tế bào, một quá trình khá chậm. Đây là một trong những lý do chính tại sao trong một cây bị nhiễm virút, nồng độ virus lại giảm tích phân khi tiến dần về cả chồi đỉnh và chồi nách.
Tách phần đỉnh, gọi là đỉnh sinh trưởng, trong điều kiện vô trùng và nuôi cấy trên một môi trường dinh dưỡng hợp lý, có thể phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Trình tự phát triển này, theo nguyên tắc, tiếp theo tiến trình tương tự như sự phát triển bình thường của cây. Các tế bào của mô đỉnh sinh trưởng phân chia và các mô mới tiếp tục biệt hóa. Dinh dưỡng cho phần cắt ra từ cây được cung cấp bởi môi trường nhân tạo. Kỹ thuật này, được gọi là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, được Morel và Martin (1952) đưa vào sử dụng trên Dahlia cách đây 30 năm và cho ra các cây không có mầm bệnh.
Việc tách mô phân sinh vô trùng là một quá trình tinh vi và đòi hỏi nhiều sự luyện tập. Trình tự tách được trình bày bằng hình ảnh (Hình 3) và được thực hiện như sau.
Các thân cây được cắt ra từ cây vừa mới trải qua liệu pháp nhiệt cho các đoạn có chứa đốt với các chồi. Lá được loại bỏ cẩn thận, các đoạn thân được khử trùng trong 30 giây với cồn 70%, tiếp theo là 2,5% calcium hypochlorite trong 15 phút. Sau đó, các đoạn thân được rửa bốn lần mỗi lần 5 phút với nước cất vô trùng để loại bỏ hypochiorite thừa.
Dưới kính hiển vi phẫu thuật, các lá xung quanh đỉnh sinh trưởng được cắt bỏ cho đến khi chỉ có vòm đỉnh và một vài lá sơ khởi. Vòm đỉnh và hai lá sơ khởi được cắt và chuyển sang nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (xem phụ lục). Mỗi tuần, vòm đỉnh được cấy chuyền sang môi trường mới. Sau 6-8 tuần, các cây con nhỏ được nuôi cấy để tăng trưởng và nhân giống (Espinoza et al 1984).
Sau khi tái sinh từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, cây được kiểm tra (chỉ số) để phát hiện các virus khó xử lý. Phần dưới xem phần tham khảo Mục 9:
Fribourg, C., Nakashima, J. 1981 - Latex test
Salazar, L.F. 1981 - PSTV detection
Salazar, L.F. 1982 - Virus detection
Salazar, L.F. 1983 - ELISA
7. DUY TRÌ NUÔI CẤY
Vật liệu in vitro có thể được bảo tồn vô thời hạn khi được chăm sóc cẩn thận để tránh nhiễm, và chuyển sang môi trường mới trong khoảng thời gian thích hợp. Các mẫu bệnh thử nghiệm in vitro có thể lưu giữ dưới dạng các bộ sưu tập cơ bản để nhân giống trong chương trình giống.
Để duy trì ngắn hạn, cây trồng được trồng trên các ống môi trường nhân giống B (xem Phụ lục). Các ống được đầy bằng nắp nhựa có thể hấp. Việc này tốt hơn so với nút bông vốn có thể dễ bị xâm nhập bởi các bào tử nấm và côn trùng.
Tốc độ tăng trưởng của cây phụ thuộc vào nhiệt độ, thành phần môi trường và kiểu gen.
Môi trường lưu trữ dài hạn C và D ( xem Phụ lục) gây stress thẩm thấu trên cây trồng và có thể được sử dụng để lưu trữ ở 25oC, stress làm giảm tốc độ tăng trưởng và gây ra các lóng ngắn. Vật liệu lưu trữ trong những điều kiện này thường chỉ cần được cấy chuyền một năm một lần.
Khi sử dụng môi trường C, nhiệt độ có thể giảm xuống 8oC. Điều này làm giảm đáng kể tốc độ tăng trưởng của cây và việc cấy chuyền chỉ được thực hiện 2 hoặc 3 năm một lần.
Do đó, có thể duy trì bộ sưu tập nguồn gen dưới các điều kiện bảo quản nêu trên. Khi yêu cầu xuất một mầm bệnh cụ thể đã kiểm tra kiểu gen, thì có thể được lấy ra từ bộ lưu giữ, được nhân vi nhân giống và chia vào ống nghiệm.
8. PHỤ LỤC (CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG)
Tất cả môi trường dựa trên các loại muối của Murashige và Skoog (1962). Dung dịch stock được chuẩn bị thành 4 phần:
- Các loại muối
- MgSO4
- Sắt
- Các loại vitamin
Dung dịch stock muối: hòa tan mỗi loại muối trong 200cm3 nước cất
- NH4NO3 :35 g
- KNO3: 40 g
- CaCl .2H20: 9 g
- KH2PO4: 3.5 g
- H3BO3: 0.1 g
- MnSO4.4H20: 0.5 g
(MnSO4.H20: 0.4 g)
- ZnSO4.7H20: 0.2 g
(ZnSO4.H20: 0.1 g)
- KI: 0.02 g
- Na2MoO4.2H20: 0.005 g
Hòa tan 5mg (0.005g) của các loại muối sau với nhau trong 10cm3 nước; và 1cm3 của dung dịch này trong 200 cm3 nước cho dung dịch stock
- CuSO4.5H20 và CoCI2.6H20
Trộn 10 loại dung dịch muối khác nhau với nhau để được 200 cm3của dung dịch stock muối
Dung dịch stock MgSO4
- MgSO4.7H20 3.7g trong 100 cm3 nước cất
Dung dịch stock sắt
- Na2EDTA 0.75g
- FeSO4.7H20 0.55g
Hòa tan FeSO4.7H2O trong 20 cm3 nước cất, Na2EDTA trong 20 cm3nước cất ấm. Trộn các dung dịch,làm nguội và đong đủ 100 cm3bằng nước cất.
Dung dịch stock vitamin
- Thiamine HCl 40mg trong 100 cm3 nước cất
Chuẩn bị môi trường. Chuẩn bị 1L (dm3) dung dịch muối Murashige-Skoog cơ bản bằng cách trộn các stock dung dịch với inositol theo tỉ lệ sau:
Các loại muối :100 cm3
MgSO4: 10 cm3
Sắt: 5 cm3
Vitamin: 1 cm3
Inositol :100mg
Bổ sung các hormon thích hợp và sucrose (xem phần dưới), và hấp môi trường có hoặc không có agar trong 15 phút.
Thêm vào môi trường MS cơ bản để chuẩn bị các môi trường đặc biệt
|
Môi trường |
Thành phần bổ sung |
A
(đỉnh sinh trưởng) |
0.25 |
Ppm |
Acid gibberellic |
|
2.00 |
Ppm |
Acid Ca Pantothenic |
|
3.0 |
% |
Sucrose |
|
0.6 |
% |
Agar |
|
B (nhân giống) |
0.25 |
Ppm |
Acid gibberellic |
|
2.00 |
Ppm |
Acid Ca Pantothenic |
|
3.0 |
% |
Sucrose |
|
0.8 |
% |
Agar |
|
C (giữ giống) |
4.0 |
% |
Mannitol |
|
3.0 |
% |
Sucrose |
|
0.8 |
% |
Agar |
|
D (giữ giống) |
4.0 |
% |
Mannitol |
|
0.5 |
% |
Sucrose |
|
0.8 |
% |
Agar |
9. TÀI LIỆU THAM KHẢO
Butenko, R.G. 1964. Plant tissue culture and plant morphogenesis. Translated from Rusian Jerusalem. Israel Program for Scientific Translations 1968.
Espinoza, N.; Estrada, R.; Tovar, R.; Bryan, J.; Dodds, J.H. 1984. Tissue culture micropropagation, conservation, and export of potato germplasm. Specialized f!chnology Document 1. International Potato Center, Lima, Peru. 20 pp.
Fribourg, C.; Nakashima, J. 1981. Latex test for detecting potato viruses. Slide Set, 31 slides; Guide Book, 12 pp. International Potato Center, Lima, Peru.
Gautheret, R. J. 1959. La culture Les tissus v~g6taux: Techniques et ralisations. Mason, Paris.
Kassanis, B. 1957. The use of tissue culture to produce virus free clones from infected potato varieties. Ann. App. Biol. 45: 422-427.
Lizarraga, 1.E.; Salazar, L.F.; Roca, W.i.; Schilde-Rencscheler, L. 1980. Elimination of potato spindle tuber viroid by low temperature and meristem culture. Phytopathology 70: 754-755.
Lizarraga, R.E.; Salazar, L.F. 1982. Effect of meristem size on eradication of potato spindle tuber viroid. pp. 118-119. In: Hooker, W.J.Research for the potato in the year 2000. International Potato Center,Lima, Peru. 199 pp.
Morel, G.M.; Martin, C. 1952. Guerison de dahlias atteints d'une maladle A virus. Comptes rendus hebdomaire des seances de l'Academie des Sciences, Paris. 235: 1324-1325.
Murashige, T.; Skoog, F.C. 1962. A revised medium for rapid growth and bioessays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497.
Pennazio, S.; Redolfi, P1. 1973 . Factors affecting the culture in vitro of potato meristem tips. Potato Res. 16: 20-29.
Quak, F. 1977. Meristem culture and virus free plants. pp. 598-615. In: Reinert, J.; bajaj, Y.P.S. (Lds.) Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture. Springer, Berlin.
Salazar, L.F. 1981. Detection of PSTV by gel electrophoresis. Slide Set, 38 slides; Guide Book, 10 pp. International Potato Center, Lima, Peru.
Salazar, L.F. 1982. Virus detection in potato seed production. Technical Intormation Bulletin 18. International Potato Center, Lima, Peru. 14 pp.
Salazar, L.F. 1983. Derection ot potato viruses with ELISA. Slide Set, 32 slides; Guide Book, 12 pp. International Potato Center, Lima, Peru.
Sanger, H.L.; Ramm, K. 1975. Radioactive labelling of viroid RNA. pp. 230-253. In: Markham et al. (Eds.) Modification of the information content of plant cells. Proc 2nd. John Inner Symposium, Nonwick U.K.
Stace-Smith, R.; Mellor, F.C. i970. Eradication of potato spindle tuber vi:us by thermother~py and axiliary bud culture. Phytopathol. 60: 1957-195P.
Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com