Một vấn đề trong việc nhân rộng loài cây trồng này là nguồn giống. Các đơn vị sản xuất gần như đã sử dụng nguồn nhập khẩu với giá thành cao và chất lượng không ổn định. Hiệu quả của phương pháp nhân giống bằng củ thấp, cây con dễ bị bệnh và phụ thuộc vào vụ mùa. Nuôi cấy tế bào thực vật là một kỹ thuật có khả năng sản xuất một số lượng lớn cây con chất lượng cao. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh và tăng trưởng cây con in vitro đã được kiểm tra. Số lượng chồi tái sinh cao nhất trên môi trường MS bổ sung với TDZ 0.5 mg/l và sucrose 30 g/l; số rễ là cao nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 0.2 mg/l và sucrose 30 g/l; đường kính củ in vitro là lớn nhất. Các cây con in vitro sống sót trong nhà kính với tỷ lệ cao. Một quy trình nhân giống lily một cách nhanh chống đã được thiết lập.

 

Chi Lilium là một trong khoảng 220 chi thuộc Liliaceae và có khoảng 85 loài, bao gồm nhiều loài dùng làm cảnh rất đẹp. Nhiều giống cây thuộc chi Lilium có giá trị trang trí như hoa cắt cành (De Jong 1974), có nguồn gốc từ sự lai giống giữa các loài. Lilium, tulip và freesia là ba cây thân vảy quan trọng nhất trên thị trường thương mại, chiếm 24% tổng sản lượng hoa (Robinson và Firoozabady 1993, Beattie và White 1993). Trong 3 thập kỷ qua, tầm quan trọng của hoa lily trong nghề làm vườn đã tăng lên đáng kể, đặc biệt là tại Hà Lan, nơi sản xuất củ lily tăng từ 100 ha vào năm 1966 lên khoảng 5000 ha vào năm 2001 với sản lượng khoảng 1.000 triệu củ được sản xuất (Van Tuyl và Van Holsteijn, 1996). Lý do cho sự gia tăng này là sự tiến bộ trong việc tạo giống hoa lily, các khả năng cải tiến cho việc sản xuất củ và việc áp dụng nhân giống in vitro. Các loài Lilium là những cây vảy củ, một lá mầm có tầm quan trọng về mặt thương mại vì chúng có hoa đẹp, hấp dẫn. Các vảy củ con có thể phát triển thành các củ lớn hơn sau khi phá ngủ bằng cách xử lý lạnh. Sự nhân giống lily có thể được thực hiện bằng cách tái sinh những vảy củ con, được hình thành ngẫu nhiên ở dưới những vảy lily được tách ra trong suốt quá trình bảo quản ở 25°C trong vermiculit, trong than bùn ẩm hoặc trong đất (De Klerk và cộng sự, 1992).
 

Lily và các cây thân vảy một lá mầm quan trọng khác, tương đối khó thao tác trong nuôi cấy in vitro hơn những cây 2 lá mầm vì trạng thái ngủ, một yếu tố vẫn chưa được hiểu rõ (Kim và cộng sự, 1994) ảnh hưởng đến việc nhân giống các loài cây thân vảy. Trạng thái ngủ cho phép cây trồng có thể vượt qua điều kiện khí hậu bất lợi ở nhiều loài (De Klerk và cộng sự, 1992) và từ quan điểm thực tế, kiểm soát trạng thái ngủ in vitro là rất cần thiết và có thể thực hiện được bằng cách xử lý lạnh với các củ con. Đối với nhiều loại cây trồng nông nghiệp, các quy trình đã được xây dựng, nhưng chỉ ở một mức độ hạn chế đối với các loài cây cảnh thân vảy.
 

Việc vi nhân giống lily bằng củ như là một phương pháp thay thế cho các phương pháp thông thường để nhân giống thực vật trở nên quan trọng với những lợi ích nhất định như tăng tỷ lệ nhân và sự chú ý của vật liệu thực vật không có virut và các mầm bệnh khác. Quá trình vi nhân giống in vitro của các loài Lilium bằng cách sử dụng vảy củ như là nguồn mẫu cấy để sản xuất ra các củ con đã được báo cáo (Tanimoto và Matsubara 1995). Trong bài báo này, một quy trình nhân chồi, tái sinh cây con tới việc thích nghi môi trường của các cây trong nhà kính đã được chuẩn hóa bằng cách nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của cytokinin, auxin, và than hoạt tính lên sự nhân chồi nụ, sự hình thành củ và rễ.

Các vảy củ (hình 1) có nguồn gốc từ củ Lilium sp. in vitro được nuôi cấy trong môi trường MS (1962) bổ sung 6-benzyladenin 0.5 mg/l, sucrose 30 g/l và agar 8 g/l.
 

Quá trình nhân chồi
 

Môi trường MS được cải tiến (1/2 MS) bổ sung với các nồng độ khác nhau của BA hoặc Kinetin (Kin) hoặc thidiazuron (TDZ), sucrose 30 g/l và agar 8 g/l được sử dụng để nhân chồi nụ từ vảy củ Lilium in vitro.
 

Hình 1. Vi nhân giống Lilium từ các vảy củ in vitro
 

a. Chồi, b. Vảy củ c. Vảy củ được nuôi cấy, d. Chồi tái sinh, e. Cây con, f. Cây con trồng trong nhà kính, g. Cây trồng ra đồng
 

Môi trường MS và 1/2 MS bổ sung với các nồng độ khác nhau của α-naphthalen axit axetic (NAA), sucrose 30 g/l, agar 8 g/l có hoặc không có than hoạt tính (AC) 1 g/l được sử dụng tạo rễ cho các chồi có nguồn gốc từ vảy củ in vitro của Lilium.
 

Môi trường được chứa trong các bình nuôi cấy 250 ml ở thể tích 40 ml mỗi bình; pH của môi trường đã được điều chỉnh đến 5,8 trước khi hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm trong 30 phút.
 

Các vảy củ Lilium được đặt ở 25 ± 1oC và độ ẩm tương đối 70-80%, với cường độ ánh sáng 45 µmol m-2s-1 được cung cấp bởi đèn huỳnh quang trắng mát cho thời gian ánh sáng 10 giờ mỗi ngày.
 

Quá trình thích nghi môi trường
 

Các cây con Lilium đồng nhất thu được từ vảy củ đã được thu thập và chuyển vào nhà kính để theo dõi sự tăng trưởng và phát triển.
 

Ảnh hưởng của BA, TDZ, Kinetin lên sự tái sinh chồi và sự hình thành củ từ vảy củ Lilium

Sau sáu tuần nuôi cấy, quan sát cẩn thận sự tái sinh chồi và sự hình thành củ, dữ liệu sẽ được trình bày trong Bảng 1.
 

Sự phát triển đáng kể đã được quan sát thấy ở môi trường điều hòa tăng trưởng của BA 0.2 mg/l với trọng lượng tươi tốt nhất (0.804 mg/chồi), chiều cao chồi (47.2 mm), số lượng chồi (3), số lượng lá (3.33), đường kính lá (6.3 mm), độ dài rễ (26 mm), đường kính củ (8 mm) (Bảng 1). Về mặt tái sinh chồi, không có mô hình chung cho thấy lượng chồi tăng đều với BA tăng lên thậm chí đến 1.0 mg/l. Người ta cũng quan sát thấy rằng tất cả các mẫu cấy đều tạo rễ khi BA có mặt, và môi trường bổ sung BA 0.2 mg/l có vẻ kích thích tốt nhất với số lượng rễ và độ dài rễ cao nhất (Bảng 1). Để đánh giá khả năng tạo rễ, các kết quả chỉ ra rõ ràng rằng chất lượng của củ đều tăng lên cùng với sự gia tăng quá trình hình thành rễ (Bảng 1). Trong các nồng độ khác nhau của BA, các mẫu được nuôi cấy cho thấy sự hình thành củ tốt nhất trên môi trường có chứa BA 0.2 mg/l. Nồng độ này cho thấy đường kính củ và trọng lượng tươi là cao nhất. Kết quả cũng cho thấy mối quan hệ giữa sự hình thành củ và nồng độ cytokinin phù hợp với các nghiên cứu trước đó sử dụng cytokinin để kích thích sự hình thành củ thành công hơn so với sử dụng auxin và cytokinin có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành củ kích hoạt quá trình tổng hợp tinh bột và ức chế enzym phân tích tinh bột.

Vảy củ được nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung với các nồng độ TDZ khác nhau, sự bắt đầu hình thành chồi được quan sát mỗi một tuần sau khi nuôi cấy. Phản ứng tối ưu về tỷ lệ phần trăm của các mẫu cấy tạo ra chồi và số lượng chồi nụ phát triển cao nhất trên mỗi mẫu cấy được ghi nhận trên môi trường MS được bổ sung TDZ 0.5 mg/l. Trên môi trường nuôi cấy 100% này có trung bình 9 chồi trên mỗi môi trường. Chồi được tái sinh đạt được trọng lượng tươi khoảng 723.7 mg/chồi trong khoảng 42 ngày nuôi cấy. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về sự tái sinh chồi hay sự hình thành củ trong môi trường MS có bổ sung Kinetin với các nồng độ khác nhau. Số lượng chồi chỉ có 1. Chỉ một vài củ được sản xuất. Tuy nhiên, môi trường có chứa Kinetin cho thấy có hiệu quả hơn trong việc sản xuất các cây hoàn chỉnh so với các môi trường thử nghiệm khác.
 

Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính lên sự tăng trưởng của rễ và củ Lilium
 

Sau 6 tuần nuôi cấy, sự hình thành rễ và củ được quan sát cẩn thận. Chiều dài rễ, đường kính củ và trọng lượng tươi của Lilium đã được thu thập và dữ liệu chi tiết được thể hiện trong Bảng 2.
 

Trong số các phương pháp xử lý, môi trường ½ MS được bổ sung NAA 0.2 mg/l cho kết quả tốt nhất. Các mẫu được nuôi cấy trong môi trường này có số lượng rễ, chiều dài rễ, đường kính củ và trọng lượng tươi cao hơn so với các mẫu nuôi cấy trong môi trường khác (Bảng 2).
 

Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ, Kinetin lên sự tái sinh chồi và sự hình thành củ từ vảy củ Lilium

Bảng 2. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính lên sự tăng trưởng của rễ và củ của cây con Lilium từ vảy củ

Hình 2. Ảnh hưởng của BA, TDZ, Kinetin lên sự tái sinh chồi và sự hình thành củ từ vảy củ Lilium
 

a1. 0.1 mg/l BA, a2. 0.2 mg/l BA, a3. 0.5 mg/l BA, a4. 1.0 mg/l BA 

b1. 0.1 mg/l TDZ, b2. 0.2 mg/l TDZ, b3. 0.5 mg/l TDZ, b4. 1.0 mg/l TDZ 

c1. 0.1 mg/l Kin, c2. 0.2 mg/l Kin, c3. 0.5 mg/l Kin, c4. 1.0 mg/l Kin

Hình 3. Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính lên sự tăng trưởng của rễ và củ của cây con Lilium từ vảy củ. a.MS, b. 1/2 MS, c. 1/2 MS + 1 g/l AC, d. 1/2 MS + 0.1 mg/l NAA,  e. 1/2 MS + 0.2 mg/l NAA
 

Than hoạt tính (AC) có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển và biệt hóa tế bào ở một số loài thực vật như hoa phong lan, hành tây, cà rốt ... Trong nghiên cứu này, thêm 1.0 g/l AC vào môi trường ½ MS để điều tra liệu có hay không tăng cường sự tăng trưởng của rễ và củ của cây con Lilium từ vảy củ. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa việc có bổ sung AC và không có bổ sung AC (Bảng 2). Kết quả tương tự cũng thu được với số lượng rễ, độ dài rễ, đường kính củ, trọng lượng tươi so với MS và ½ MS không có AC.
 

Trong thí nghiệm hiện nay, khoảng 1.000 cây Lily tái sinh được chuyển từ điều kiện in vitro và đưa vào chậu nhựa có chứa đất vườn, cát với tỷ lệ 2: 1. Tỷ lệ sống sót của cây con dưới điều kiện in vivo trên đất là 97%.
 

Bài báo này khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh, sự hình thành củ và sự tăng trưởng của cây con Lilium in vitro từ vảy củ. Số lượng chồi nụ tái sinh là cao nhất trên môi trường MS được bổ sung TDZ 0.5 mg/l; Số lượng rễ cao nhất trên môi trường ½ MS bổ sung NAA 0.2 mg/l; Đường kính củ in vitro lớn nhất trên môi trường MS bổ sung BA 0.2 mg/l. Các cây con in vitro sống sót trong vườn ươm ở mức cao. Một quy trình đã được thiết lập để nhân giống nhanh Lily.
 

Các tác giả đánh giá cao bộ môn khoa học và công nghệ (thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam) đã hỗ trợ tài chính cho nghiên cứu này.
 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

BEATTIE D.J. and WHITE J.W., 1993. Lilium-hybrid and species. In De Hertogh A. and Le Nard M. (eds.): The Physiology of Flower Bulbs. Elsevier Amsterdam, 1993, pp. 342-423.

DE JONG P.C., 1974. Some notes on the evolution of lilies, LiLy. Yearb N. Am. Lily Soc. 27: 23-28.

DE KLERK G.J., DELVALLEE I. and PAFFEN A., 1992. Dormancy release of micropropagated bulblets of Lilium speciosum after long culture in soil. HortSci. 27(2): 147-148.

KIM K.S., DAVELAAR E. and DE KLERK G.J., 1994. Abscisic acid controls dormancy development and bulb formation in Lily plantlets regenerated in vitro. Physiol. Plant. 90: 59-64.

MURASHIGE T. and SKOOG F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Plant. Physio. 15: 473-477.

ROBINSON K.E.P. and FIROOZABADY E., 1993. Transformation of floriculture crops. Scientia Hortic. 55: 83-99.

TANIMOTO S. and MATSUBARA Y., 1995. Stimulating effect of spermine on bulblet formation in bulb-scale segments of Lilium longiflorum. Plant Cell Rep. 15: 279-300.

VAN TUYL J.M. and VAN HOLSTEIJN H.M.C., 1996. Lily breeding research in the Netherlands. Acta Hortic. 414: 35-45.

 

Minh Hiếu
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com

Có thể bạn quan tâm: 
1. Nuôi cấy mô trên hoa Lily Lilium speciosum Thunb. Var