Dùng Chitosan trong nuôi cấy mô thực vât. Ảnh hưởng của chitosan tôm và nấm lên sự phát triển của mô phân sinh cây hoa lan trong nuôi cấy được nghiên cứu trong môi trường lỏng và rắn.
Từ khóa: Fungal chitosan; Meristematic bud; Orchids; Protocorm; Shrimp chitosan
Tóm tắt: Ảnh hưởng của chitosan tôm và nấm lên sự phát triển của mô phân sinh cây hoa lan trong nuôi cấy được nghiên cứu trong môi trường lỏng và rắn. Sự phát triển của các mẫu mô phân sinh ở protocorm-like bodies trong môi trường lỏng đã được thúc đẩy lên 15 lần khi có mặt của chitosan oligomer, nồng độ tối ưu là 15ppm. Oligomer tôm 1kDa có hiệu quả hơn khi so với chitosan tôm 10kDa và hoạt tính 4 lần khi so với chitosan tôm khối lượng phân tử cao 100kDa . Chitosan nấm 10kDa có hiệu quả hơn khi so với oligomer 1kDa. Sự phát triển của protocorm lan ở các mô lan khác nhau với các chồi và rễ sơ khởi đã được nghiên cứu trên môi trường agar rắn. Tác động tối ưu, thế hệ của 5-7 cây con trong 12 tuần được quan sát khi có mặt 20ppm cả chitosan nấm 10kDa hay chitosan oligomer tôm 1kDa. Dữ liệu phù hợp với các kết quả trước từ các thí nghiệm ngoài đồng và xác nhận rõ ràng rằng hàm lượng nhỏ chitosan có ảnh hưởng sâu sắc lên sự tăng trưởng và phát triển của mô cây lan.
Giới thiệu
Chitin là polysaccharide tự nhiên, bao gồm copolymer của N-acetyl-D-glucosamine và dư lượng D-glucosamine, liên kết bởi nối beta-1,4 glycosidic. Nó hiện diện trong nhiều loài: trong vỏ động vật giáp xác, trong lớp vỏ của côn trùng và trong tế bào nấm và một vài loài tảo. Dạng deacetyl của chitin là chitosan. Polymer sinh học chitosan có nhiều ứng dụng trong xử lý nước thải, bột giấy và giấy, trong các sản phẩm dược và mỹ phẩm, công nghệ sinh học, thực phẩm và thức ăn động vật và các loại màng [1]. Trong nông nghiệp, chitosan được dùng trong bao phủ hạt, lá, trái và rau quả [2], như phân bón và điều khiển giải phóng hóa chất nông nghiệp [3], tăng sản phẩm thực vật [4-6], kích thích miễn dịch của cây [7], bảo vệ cây chống lại vi sinh vật [8-10] và kích thích tăng trưởng. Trong các nghiên cứu sau này, tác động tích cực của chitosan đã được quan sát trong sự tăng trưởng của rễ, chồi và lá của nhiều loài bao gồm Gerbera[4] và của nhiều loại cây trồng [11]. Rễ lan được phun nhiều loại dung dịch chitosan pha loãng cho thấy sự kích thích của tăng trưởng, tạo hoa mới và nâng cao khả năng kháng nấm và virus [5].
Trong các loài lan thương mại, Dendrobium ước tính 80% tổng các giống lan nhiệt đới được vi nhân giống [12]. Giống Dendrobium được dùng trong sản xuất hoa lan [13] và trong y học dân tộc Trung Quốc [14]. Dendrobium được nhân giống trong nuôi cấy mô bằng protocorm-like bodies (PLB) nhưng sự tăng trưởng còn chậm [15]. Để kích thích hiệu quả vi nhân giống PLB, nhiều nỗ lực để cải tiến môi trường nuôi cấy, chủ yếu đưa vào các chất điều hòa tăng trưởng [16,17] như N6-benzylaminopurine và alpha-naphthaleneacetic acid [18], benzyladenine, gibberellic acid và 3-indoleacetic acid [19], nhiều loại polyamines [20], N6-benzyladenine và thidiazuron[21,22].
Nuôi cấy mô thực vật đặc biệt phù hợp nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan lên thực vật phát triển và nhân lên chậm như hoa lan. Trong nghiện cứu này, sự hình thành PLB trong đỉnh sinh trưởng búp chồi và tăng trưởng và biệt hóa của protocorm lan được nghiên cứu dưới các điều kiện nuôi cấy mô khi có và không có chitosan. Nhiều chế phẩm chitosan, cả từ nguồn gốc giáp xác và nấm cũng được so sánh ở nhiều nồng độ. Sự hình thành của mô lan biệt hóa được nghiên cứu trong môi trường lỏng và rắn. Dữ liệu tóm lược về hiệu quả của chitosan như tác nhân kích thích tăng trưởng được trình bày.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị đỉnh sinh trưởng chồi bất định PLB cho các mẫu
Cây lan non Dendrobium phalaenopsis được thu từ Orchid Garden, Ratchaburi, Thailand. Mẫu chồi với một hay hai mô phân sinh chồi bên (6-15mm) được tách ra. Các mẫu chồi này được rửa sạch với xà phòng và vòi nước chảy 3 lần và ngâm trong dung dịch khử trùng (5.25% sodium hypochlorite với một vài giọt xà phòng) để khử trùng bề mặt. Sau đó các mẫu chồi được rửa nhiều lần trong nước cất vô trùng để làm sạch chất khử trùng và không làm tổn thương mẫu. Mô phân sinh chồi bên được tách từ các mẫu chồi và nuôi cấy trong môi trường VW lỏng cải tiến [23]. Protocorm lan Dendrobium 3 tháng tuổi được lấy từ Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô thực vật, Chatuchak Weekend Market, Bangkok, Thailand.
Môi trường và điều kiện nuôi cấy
Môi trường VM [23] chứa 20 g/l sucrose, 150 ml/l nước dừa, 0.525 g/l KNO3, 0.25 g/l KH2PO4, 0.5 g/l (NH4)2SO4, 0.007 g/l MnSO4.4H2O, 0.025g/l MgSO4.7H2O,0.028 g/l FeSO4.7H2O và 0.037 g/l Na2-EDTA. Nước dừa được lấy từ chợ địa phương , Bangkok, Thailand. Môi trường được bổ sung ở các hàm lượng chitosan, cả chitosan từ vỏ tôm với khối lượng phân tử 100 hay 10 kDa [24]. Oligomer chitosan 1kDa được lấy từ Kittolife Co. Ltd., Korea. Chitosan 10 kDa được tách từ thành tế bào nấm [25]. pH môi trường được chỉnh về 4.9 ở môi trường lỏng. Môi trường rắn được thêm agar (12g/L của Sigma) vào môi trường lỏng. Môi trường lỏng (50mL) trong bình thí nghiệm Erlenmeyer 250mL và 10mL môi trường rắn trong ống nghiệm (150x25mm) được hấp vô trùng trong 20 phút ở 121oC.
Đỉnh sinh trưởng chồi bên được dùng như mẫu trong môi trường lỏng. Protocorm-like bodies (PLB) (khối lượng tươi 0.03-0.04g) được dùng làm mẫu trong môi trường lỏng và rắn. Nuôi cấy lỏng uy trì ở 27oC và 100rpm. Nuôi cấy rắn giữ ở 27oC và thời gian chiếu sáng 16h một ngày bằng ống đèn huỳnh quang trắng (TLD 18 W/54ϕ4A, Daylight 1030 lm, 57 lm/W, Philips, Thailand).
Ghi nhận và phân tích dữ liệu
Các quan sát trực quan được thực hiện mỗi ngày. Tổng khối lượng tươi của protocorm-like bodies được ghi nhận ở 0 và 3, 6, 8 và 12 tuần. Số cây con tái sinh bằng PLB duy trì trên môi trường rắn được đếm sau 12 tuần nuôi cấy. Ba lần lặp lại được thực hiện trong mỗi thí nghiệm. Tất cả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS, phiên bản 7.2, sử dụng phân tích ANOVA một chiều. Tất cả hình ảnh đại diện cho các điều kiện tăng trưởng được trình bày.
Kết quả và thảo luận
Ảnh hưởng của chitosan tôm lên sự tăng trưởng mô phân sinh chồi lan trong môi trường lỏng
Mô phân sinh chồi của cây lan trưởng thành khởi đầu hình thành PLB khi nuôi cấy trên môi trường VW lỏng. Sự tăng trưởng cùa mô phân sinh phụ thuộc vào kích thước của mẫu cấy và các điều kiện tăng trưởng. PLB phát triển trên môi trường lỏng bổ sung 15ppm chitosan tôm với các khối lượng phân tử khác nhau (100, 10 kDa và oligomer 1 kDa). Sau 3 tuần, mô phân sinh chồi lan nuôi cấy bổ sung oligomer chitosan cho thấy tế bào nhân lên nhiều hơn các môi trường bổ sung 10 và 100 kDa chitosan (p<0.05). Khối lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy trước tăng khoảng 15 lần sau 6 tuần nuôi cấy. Khối lượng phân tử chitosan (100kDa) không có ảnh hưởng kích thích (Hình 1).
Ảnh hưởng của nồng độ chitosan lên sự tăng trưởng của PLB từ mô phân sinh chồi được đánh giá trong môi trường lỏng bổ sung 0, 5, 10, 15, 20 và 25ppm của oligomer chitosan. Môi trường bổ sung với 10 và 5 ppm tạo PLB kích thước lớn hơn khi so với các nghiệm thức khác. Khối lượng tươi tối đa của PLBs thu được trong môi trường nuôi cấy bổ sung 15ppm oligomer chitosan (Hình 2). Dưới điều kiện này mô phân sinh được tách ra bắt đầu tăng về kích thước và chuyển thành thể tròn nhỏ trong 3 tuần đầu, sau đó các lá non xuất hiện sau 5 tuần (Hình 3). Trong môi trường với 5, 20 và 25 ppm oligomer chitosan, kích thước PLB không tăng sau 6 tuần nuôi cấy.
Hình 1. Ảnh hưởng của chitosan tôm với khối lượng phân tử khác nhau. protocorm-like bodies (PLBs) lan được nuôi cấy trong 0, 3 và 6 tuần trên môi trường VW lỏng bổ sung chitosan tôm với khối lượng phân tử 1kDa (oligo-chitosan), 10 và 100 kDa. Độ lệch chuẩn được tính từ 3 thí nghiệm độc lập bằng ANOVA một chiều.
Hình 2. Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của oligomer chitosan lên khối lượng PLB sau 0, 21 và 42 ngày nuôi cấy trong môi trường VW lỏng. Độ lệch chuẩn được tính từ các thí nghiệm độc lập bằng ANOVA một chiều.
Ảnh hưởng của chitosan có nguồn gốc từ tôm và nấm lên sự tăng trưởng PLB trong môi trường lỏng
Ảnh hưởng của chitosan từ tôm và nấm lên PLB được so sánh khi dùng chitosan tôm 1kDa, 10 kDa và chitosan nấm 10kDa trong môi trường lỏng ở các nồng độ 0-5ppm. Khối lượng tươi của PLB gia tăng. Các kết quả thể hiện trong Hình 4. Protocorm (khối lượng ban đầu 0.03-0.04g) trong môi trường bổ sung oligomer và chitosan nấm ở 3 nồng độ 10, 15 và 20-ppm cho khối lượng PLB cao hơn khi so với môi trường đối chứng không có chitosan (p<0.05). Sau 6 tuần, môi trường với 15ppm chitosan nấm cho thấy sự kích thích gia tăng khối lượng tươi 30 lần khi so với khối lượng PLB lúc đầu. Trong cùng thời gian ở nghiệm thức đối chứng, không có sự kích thích gia tăng khối lượng 5-6 lần. Sự gia tăng không do kích thích cũng được quan sát thấy trong nuôi cấy với oligo chitosan 1kDa và chitosan nấm 10kDa trong các nồng độ 5 và 25 ppm và trong tất cả các nuôi cấy với chitosan 10kDa.
Trong môi trường bổ sung 10kDa chitosan tôm, một ít kết tủa nâu được quan sát thấy sau 2 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên màu sắc và độ trong của môi trường không đổi trong suốt quá trình nuôi cấy 6 tuần sau đó. Cũng như trong môi trường bổ sng chitosan nấm, một phần rất nhỏ tủa đen được hình thành sau 2 ngày nhưng dung dịch vẫn trong. Sau 8 tuần thí nghiệm, 15ppm chitosan nấm cho thấy ảnh hưởng nhiều nhất trong nhân PLB khi định lượng sự gia tăng khối lượng tươi (Hình 5). Vì vậy chitosan nấm là chất thích hợp khi dùng để kích thích sự tăng trưởng trong môi trường VW lỏng trong nuôi cấy mô cây lan.
Hình 3. Ảnh hưởng của oligo chitosan tôm (15ppm) lên sự phát triển của protocorm lan từ mô phân sinh sau 6 tuần nuôi cấy trong môi trường VW
Hình 4. Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của chitosan tôm và nấm lên sự gia tăng tổng khối lượng tươi PLB sau 6 tuần nuôi cấy trong môi trường VW lỏng. Chitin tôm 10kDa, oligomer tôm 1kDa, chitosan nấm 10kDa. Độ lệch chuẩn được tính từ các thí nghiệm độc lập bằng ANOVA một chiều.
Hình 5. Ảnh hưởng của chitosan nấm (15ppm) trong nhân PLB sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường VW.
Hình 6. Ảnh hưởng của các loại chitosan khác nhau (20ppm) trong 12 tuần nuôi cấy trên môi trường agar VW lên sự tái sinh cây con bằng mẫu PLB Dendrobium phalaenopsis trong môi trường lỏng.
Ảnh hưởng của nhiều chitosan lên sự biệt hóa tren môi trường rắn
Trong môi trường lỏng, protocorm lan chỉ tăng tổng khối lượng tươi. Tuy nhiên, các cây con mới có thể thu được bằng nuôi cấy protocorm lan khi nuôi cấy tĩnh trên bề mặt môi trường agar rắn. Trong hệ thống này, ảnh hưởng của chitosan tôm 1 và 10 kDa và chitosan nấm 10kDa được so sánh trong khoảng 0-25ppm.
Tiêu chí quan trọng trong sự phát triển của cây con là hình thành mô biệt hóa xanh tươi. Mô xanh được quan sát ở các protocorm sau 2-3 tuần trên môi trường bổ sung chitosan. Mô biệt hóa xanh ở protocorm ở môi trường đối chứng được quan sát chỉ sau 6 tuần nuôi cấy. Sau giai đoạn nuôi cấy 12 tuần, số cây con trên môi trường bổ sung 10kDa chitosan nấm cao nhất khi so với các chitosan khác (Hình 6). Dữ liệu chính xác cho ảnh hưởng của 3 loại chitosan ở 5 nồng độ sau 12 tuần nuôi cấy được thể hiện ở Bảng 1. Năm đến bảy cây con được tái sinh từ protocorm xanh trên môi trường bổ sung 20ppm chitosan nấm 10kDa hay oligomer chitosan 1kDa. Protocorm trên môi trường bổ sung 5 và 10 ppm chitosan nấm không hình thành cây con trong 12 tuần nuôi cấy. Các hình đại diện của thí nghiệm nuôi cấy được thể hiện ở Hình 7. Ảnh hưởng tương tự của chitosan khối lượng phân tử thấp được quan sát trong tái sinh mô sẹo cà rốt và tái snh rễ và chồi ở dâu tây [26]. Môi trường rắn tốt nhất cho nuôi cấy mô lan là môi trường bổ sung 20ppm chitosan 10kDa hay oligomer chitosan 1 kDa.
So sánh dữ liệu từ các thí nghiệm ngoài đồng
Dữ liệu trong nuôi cấy mô trình bày ở đây cung cấp các quan sát sơ bộ thực hiện trên đồng, khi phun chitosan khối lượng phân tử thấp ở các liều 15-20ppm đến các kết quả cây lan khi cân nhắc ảnh hưởng tích cực lên sự tăng trưởng cây [4-6, 11]. Thêm vào đó, chitosan hoạt động như thành phần kháng nấm. Dữ liệu xác nhận rõ rằng hàm lượng nhỏ chitosan có ảnh hưởng sâu đến sự tăng trưởng và phát triển của mô lan [8-10]. Chitosan có sự kết hợp độc nhất của các đặc tính: kích thích tăng trưởng, cải thiện bảo vệ cây, thân thiện môi trường vì có nguồn gốc thiên nhiên và dễ bị phân hủy nhờ vi sinh vật đất. Sự kết hợp của các tính trạng này khiến chitosan là tác nhân kiểm soát sinh học hữu ích với quan điểm lớn trong trồng trọt nói chung và nuôi cấy lan nói riêng.
Bảng 1. Số cây con tái sinh bằng protocorm lan phát triển trên môi trường VW rắn bổ sung các nồng độ khác nhau của chitosan tôm, oligomer chitosan và chitosan nấm sau 12 tuần nuôi cấy.
Tất cả dữ liệu là trung bình của ba lần thí nghiệm lặp lại độc lập và độ lệch chuẩn được tính bằng ANOVA một chiều.
Hình 7. Ảnh hưởng của các nồng độ của chitosan tôm (10 kDa) lên việc tạo cây con bằng mẫu PLB Dendrobium phalaenopsis nuôi cấy trên môi trường agar VW. Hình ảnh chụp ở tuần 12.
Kết luận
Chitosan khác nhau được đánh giá ảnh hưởng của chúng lên nuôi cấy mô phân sinh cây lan và nhân protocorm lan trong môi trường lỏng và rắn. Theo các kết quả đạt được, chitosan có khả năng kích thích hình thành biệt hóa mô cây lan. Chitosan nấm và oligomer chitosan tôm ở 15 và 20 ppm có ảnh hưởng nhất trong nhân protocorm trong môi trường nuôi cấy mô cây lan dạng lỏng và rắn.
Lời cảm ơn
Các tác giả cảm ơn Prince de Lignac, Prospect Burma và Viện Open Society đã cung cấp nguồn tài trợ, Ông Suwitchai Sangtein (Orchid Garden, Ratchaburi, Thailand) đã cung cấp cây lan con và TS. Oradee Sahavacharin đã hướng dẫn kỹ thuật nuôi cấy mô.
Tài liệu tham khảo
Khin Lay Nge a, Nitar New a, Suwalee Chandrkrachang ab, Willem F. Stevensa b*
a Bioprocess Technology, Food Engineering and Bioprocess Technology, Asian Institute of Technology, P.O. Box 4, Klong Luang, Pathumthani 12120, Bangkok, Thailand
b Center for Chitin and Chitosan Biomaterials, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand
[1] S. Hirano, Applications of chitin and chitosan in the ecological and environment fields, in: M.F.A. Goosen (Ed.), Application of Chitin and Chitosan, Technomic Publishing Company, 1997, pp. 31–54, ISBN 1-56676-449-1.
[2] F. Devlieghere, A. Vermeulen, J. Debevere, Chitosan: antimicrobial activity, interactions with food components and applicability as a coating on fruit and vegetables, Food Microbiol. (2004) 703–714.
[3] M. Sukwattanasinitt, A. Klaikherd, K. Skulnee, S. Aiba, Chitosan as a releasing device for 2,4-D herbicide, in: T. Uragami, K. Kurita, T. Fukamizo (Eds.), Chitin and Chitosan, Chitin and Chitosan in Life Science, Yamaguchi, 2001, pp. 142–143, ISBN 4-906464-43-0.
[4] P. Wanichpongpan, K. Suriyachan, S. Chandrkrachang, Effects of chitosan on the growth of Gerbera flower plant (Gerbera jamesonii), in: T. Uragami, K. Kurita, T. Fukamizo (Eds.), Chitin and Chitosan in Life Science, Yamaguchi, 2001, pp. 198–201, ISBN 4-906464-43-0.
[5] S. Chandrkrachang, The applications of chitin and chitosan in agriculture in Thailand, in: K. Suchiva, S. Chandrkrachang, P. Methacanon, M.G. Peter (Eds.), Advances in Chitin Science, vol. 5, Bangkok, 2002, pp. 458– 462, ISBN 974-229-412-7.
[6] N. Nwe, S. Chandrkrachang, W.F. Stevens, Application of chitosan in Myanmar’s agriculture sector, in: Proceedings of the Sixth Asia Pacific Chitin and Chitosan Symposium, May 23–26, The National University of Singapore, Singapore, 2004.
[7] L.A. Hadwiger, S.J. Klosterman, J.J. Choi, The mode of action of chitosan and its oligomers in inducing plant promoters and developing disease resistance in plants, in: K. Suchiva, S. Chandrkrachang, P. Methacanon, M.G. Peter (Eds.), Advances in Chitin Science, vol. 5, Bangkok, 2002, pp. 452–457, ISBN 974-229-412-7.
[8] H. Pospieszny, S. Chirkov, J. Atabekov, Induction of antiviral resistance in plants by chitosan, Plant Sci. 79 (1991) 63–68.
[9] H. Struszczyk, H. Pospieszny, New applications of chitosan and its derivatives in plant protection, in: M.F.A. Goosen (Ed.), Applications of Chitin and Chitosan, Technomic Publishing Co., Inc., USA, 1997,, pp. 171–184, ISBN 1-56676-449-1.
[10] S. Bautista-Ban ˇos, M. Hernandez-Lopez, E. Bosquez-Molina, C.L. Wilson, Effects of chitosan and plant extracts on growth ofColletotrichum gloeosporioides, anthracnose levels and quality of papaya fruit, Crop Protect. 22 (2003) 1087–1092.
[11] H. Chibu, H. Shibayama, Effects of chitosan applications on the growth of several crops, in: T. Uragami, K. Kurita, T. Fukamizo (Eds.), Chitin and Chitosan in Life Science, Yamaguchi, 2001, pp. 235–239, ISBN 4-906464-43-0.
[12] P.C. Debergh, R.H. Zimmerman, Micropropagation: Technology and Application, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, 1991.
[13] S. Ketsa, Y. Piyasaengthong, S. Prathuangwong, Mode of action of AgNO3 in maximizing vase life ofDendrobium‘Pompadour’ flowers, Postharvest Biol. Technol. (1995) 109–117.
[14] C. Fan, W. Wang, Y. Wang, Q. Guowei, W. Zhao, Chemical constituents fromDendrobium densiflorum, Phytochemistry (2001) 1255–1258.
[15] A.D. Hawkes, Encyclopedia of Cultured Orchids, Fabre and Fabre Limited, London, 1970.
[16] L. Prakash, C.L. Lee, C.S. Loh, C.J. Goh, in: A.S. Islam (Ed.), In Vitro Propagation of Commercial Orchids: An Assessment of Current Methodologies and Development of a Novel Approach-Thin Cross-Section Culture, Oxford and IBH Publishing Co. Pvt. Ltd., New Delhi, 1996, pp. 42–49.
[17] N.R. Nayak, S. Sahoo, S. Patnaik, S.P. Rath, Establishment of thin cross section (TCS) culture method for rapid micropropagation ofCymbidium aloifolium (L.) Sw. and Dendrobium nobile Lindl. (Orchidaceae), Scientia Hort. 94 (2002) 107–116.
[18] J. Roy, N. Banerjee, Induction of callus and plant regeneration from shoottip explants of Dendrobium fimbriatum Lindl Var. oculatum Hk. F., Scientia Hort. 97 (2003) 333–340.
[19] C.J. Goh, A.L. Yang, Effects of growth regulators and decapitation on flowering ofDendrobiumorchid hybrids, Plant Sci, Lett. (1978) 287–292.
[20] G.V.S. Saiprasad, P. Raghuveer, S. Khetarpal, R. Chandra, Effect of various polyamines on production of protocorm-like bodies in orchid Dendrobium‘Sonia’, Scientia Hort. (2004) 161–168.
[21] N.R. Nayak, S.P. Rath, S. Patnaik, In vitro propagation of three epiphytic orchids,Cymbidium aloifolium (L.) Sw., Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisch.andDendrobium moschatum (Buch-Ham) Sw.through thidiazuroninduced high frequency shoot proliferation., Scientia Hort. (1997) 243–250.
[22] R.B. Malabadi, G.S. Mulgund, N. Kallappa, Micropropagation of Dendrobium nobilefrom shoot tip sections, J. Plant Physiol. 162 (2005) 473– 478.
[23] E.F. Vacin, F.W. Went, Some pH changes in nutrient solutions, Bot. Gaz. 110 (1949) 605–617.
[24] W.F. Stevens, Production of chitin and chitosan: refinement and sustainability of chemical and biological processing, in: T. Uragami, K. Kurita, T. Fukamizo (Eds.), Chitin and Chitosan in Life Science, Yamaguchi, 2001, pp. 293–300, ISBN 4-906464-43-0.
[25] N. Nwe, W.F. Stevens, Production of fungal chitosan by solid substrate fermentation followed by enzymatic extraction, Biotechnol. Lett. 24 (2002) 131–134.
[26] L.Q. Luan, V.T.T. Ha, L. Hai, N.Q. Hien, N. Nagasawa, F. Yoshii, T. Kume, Study on the biological effect of irradiated chitosan on plant in tissue culture, in: K. Suchiva, S. Chandrkrachang, P. Methacanon, M.G. Peter (Eds.), Advances in Chitin Science, vol. 5, Bangkok, 2002, pp. 468–474, ISBN 974-229-412-7.
Khin Lay Nge a, Nitar New a, Suwalee Chandrkrachang ab, Willem F. Stevensa b*
a Bioprocess Technology, Food Engineering and Bioprocess Technology, Asian Institute of Technology, P.O. Box 4, Klong Luang, Pathumthani 12120, Bangkok, Thailand
b Center for Chitin and Chitosan Biomaterials, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand
Thông tin liên hệ:
Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com