Tự phát sinh cơ quan in vitro được nghiên cứu bằng cách sử dụng mẫu lá của cây Citrus limon L. Burm cv. ‘Primofiore’. Mục đích của nghiên cứu này là để tối ưu hóa điều kiện phát sinh mô sẹo và cơ quan của C. limon. Các mẫu C. limon được nuôi cấy trên 16 môi trường khác nhau được bổ sung tổ hợp các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau (các auxin và cytokinin), như 6-benzylaminopurine (BAP), axit naphtalene acetic (NAA), 2,4-dichlo-rophenoxyacetic axit (2,4-D) và kinetin. Việc tạo chồi ngọn tốt nhất thu được khi các mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường Murashige & Tucker bổ sung 3.5 mg/L BAP. Nghiên cứu mô học cho thấy rất có thể giai đoạn đầu của quá trình tái sinh in vitro C. limon diễn ra trong khi các mẫu lá phát triển.
 

Từ khóa: Citrus limon, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (phytohormones), các mẫu, tạo mô sẹo, auxin, cytokinin, 6-benzyloaminopurine
 

Chanh là loại trái cây rất phổ biến trên toàn thế giới vì mùi vị, hương thơm và đặc tính làm lành vết thương (Mukhtar và cộng sự 2005b, Ali và Mirza 2006, Sarma và các cộng sự 2011, Gau-rav và Richa 2012). Bên cạnh táo và chuối, các loại trái thuộc chi Citrus là loại hoa quả quan trọng nhất (FAO 2001). Chúng được sử dụng rộng rãi để phòng ngừa cảm cúm và cảm lạnh cũng như hỗ trợ hệ thống miễn dịch (Dhanavade và cộng sự 2011). Các loại trái Citrus cũng được sử dụng cho các bệnh nhân có các vấn đề về sức khoẻ như viêm dạ dày, sốt cao và xơ cứng động mạch. Nước ép chanh được sử dụng trong ngành dược phẩm vì nó có chứa một lượng lớn citric acid (một nguồn ascorbic acid và citric acid) và các loại tinh dầu (Bansode và cộng sự 2012). Ngoài ra cũng có các báo cáo về những tác động tích cực của trái chanh chống lại ung thư hệ tiêu hóa và ung thư các đường hô hấp trên (Foschi và cộng sự 2010). Chi Citrus được trồng vì trái và hương thơm của nó, một phần là do các hợp chất flavonoid và limonoid (Ashok Kumar và cộng sự 2011).
 

Citrus limon L. Burm là một loài thuộc họ Rutaceae (họ Cam Quýt) có nguồn gốc từ châu Á nhưng hiện nay chúng được trồng cho mục đích thương mại trên toàn thế giới trong những vùng khí hậu nhiệt đới và ôn đới, đặc biệt tại Mỹ, Brazil, Tây Ban Nha, Ý, Ai Cập, Mexico, Trung Quốc và Nam Phi (FAO 2001). Cây nở hoa và ra trái quanh năm. Trong các vườn ươm, hạt giống hoặc cây con đã ra rễ sau khi nhân giống được gieo hoặc trồng chủ yếu vào mùa xuân. Nhìn chung, trái sẽ được thu hoạch vào mùa đông, vì trong thời gian này trái có hàm lượng vitamin C cao. Vì các cây đại diện trong họ Rutaceae có tầm quan trọng to lớn đối với các ngành công nghiệp khác nhau, nên việc vi nhân giống Citrus luôn thu hút được nhiều sự quan tâm từ các nhà khoa học. Càng ngày càng tăng nhu cầu phát triển về các giống cây mới có thể kháng bệnh và chống lại điều kiện bất lợi của môi trường cũng như chất lượng trái cao (Yaacob và cộng sự 2014). Việc sử dụng các kỹ thuật truyền thống để tạo ra loài mới không có hiệu quả đối với cây chanh do các rào cản về sinh lý liên quan đến quá trình sinh sản hữu tính như dị hợp tử và đa phôi (Tusa và cộng sự 1990, Carimi và cộng sự 1994, Savita và cộng sự 2010, Benabdesselam và cộng sự 2011, Lombardo và cộng sự 2011). Các vườn ươm trồng chanh cũng đối mặt với một số vấn đề như sâu hại, tăng trưởng chậm, rất dễ mắc bệnh, nhạy cảm với nhiệt độ thấp, và có nhiều tổn thất trong quá trình bảo quản (Mukhtar và cộng sự 2005a, b, Savita et. al. 2010, Sarma và các cộng sự 2011). Nuôi cấy in vitro là một kỹ thuật có thể giải quyết những vấn đề này. Ngoài ra, kỹ thuật này còn có thể tạo ra số lượng cây với quy mô tương đối lớn so với việc tạo giống cây truyền thống. Hơn nữa, nuôi cấy in vitro sẽ khử nhiễm và nhanh hơn so với nuôi cấy truyền thống (Savita và cộng sự 2011, Singh và Kaur 2011).
 

Việc tạo mô sẹo và sau đó tái sinh thành cây là những giai đoạn chính khi thao tác với công nghệ sinh học in vitro. Các thành phần của môi trường và điều kiện nuôi cấy là một trong những điều quan trọng nhất ảnh hưởng đến việc phát sinh cơ quan thực vật (Rattanpal và cộng sự 2011). Do đó, trong bài báo này, chúng tôi thực hiện nghiên cứu vi nhân giống trên một giống (cultivars) của loài Citrus limon – đó là cv. 'Primofiore', đây là giống đang phát triển phổ biến nhất ở Tây Ban Nha. Chúng tôi không tìm thấy bất kỳ tài liệu sẵn có nào cung cấp thông tin liên quan đến việc vi nhân giống cho giống cây này. Chúng tôi tập trung để tối ưu hóa việc hình thành mô sẹo và tái sinh cây chanh con bằng việc sử dụng các mẫu lá. Chúng tôi cũng đã tiến hành phân tích mô học của những quy trình này vì cân nhắc đến các vấn đề đã đề cập ở trên.
 

Vật liệu thực vật và các điều kiện nuôi cấy: trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mô chanh (Citrus limon L. Burm cv. 'Primofiore') làm mẫu nguồn. Các thí nghiệm được sử dụng môi trường nuôi cấy MS (Murashige và Skoog 1962) và MT (Murashige and Tucker 1969) có bổ sung agar. Môi trường đã được chuẩn bị bằng cách pha loãng các dung dịch mẹ (stock) của các hợp chất hữu cơ, các muối khoáng và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong nước khử ion; sau đó chỉnh pH đạt 5.6-5.7 bằng máy đo pH với KOH 1M hoặc HCL 1M, sau đó môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng trong 20 phút ở nhiệt độ 121°C.
 

Hạt được thu từ những trái chanh mua trên thị trường, để khô trong hai tuần, và sau đó khử trùng bề mặt bằng ethyl alcohol 70% trong vài giây. Kế tiếp, chuyển hạt mẫu sang dung dịch 40% “Domestos” (thuốc tẩy thương mại) pha với nước khử ion vô trùng khoảng 10 phút và rửa lại 3 lần trong nước khử ion vô trùng trong 5, 10 và 15 phút. Sau khi khử trùng, hạt được đặt trong các bình chứa môi trường MS (30g/L sucrose, 7.9g/L agar) để này mầm trong điều kiện vô trùng nhằm thu cây giống. Sau đó, các mẫu nuôi cấy được đặt trong phòng có chu kỳ sáng 16/8 (16 giờ sáng, 8 giờ tối, cường độ ánh sáng 170μmol/m2/s) và nhiệt độ 23°C. Các mẫu lá được thu từ cây non sau 45 ngày nuôi cấy và chuyển lên các đĩa petri chứa môi trường MS (30g/L sucrose, 7.9g/L agar) và môi trường MT (50g/L sucrose, 8g/L agar) được bổ sung các tổ hợp khác nhau của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Thử nghiệm cảm ứng mô sẹo được thực hiện trên môi trường MS và MT bổ sung 16 tổ hợp của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, như thể hiện trong Bảng 1. Các đĩa petri được ủ 30 ngày trong tối tại nhiệt độ 23oC để kích thích tạo mô sẹo. Cuối cùng, các chồi ngọn tái sinh tốt được chuyền sang môi trường MS chứa 1mg/L NAA để tạo rễ.
 

Bảng 1: Ảnh hưởng bởi các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên quá trình tạo mô sẹo, chồi ngọn và rễ (%) của cây Citrus limon

Môi trường chứa nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau	Tạo mô sẹo (%)	Tạo chồi ngọn (%)	Tạo rễ (%)
MS + 5 mg·L-1 BAP + 1 mg·L-1 NAA	0	0	82
MS + 1 mg·L-1 KIN + 1 mg·L-1 NAA	77	0	80
MS + 0.2 mg·L-1 KIN + 1 mg·L-1 NAA	97	7	0
MS + 0.2 mg·L-1 KIN + 1 mg·L-1 2,4-D	70	3	0
MS + 1 mg·L-1 BAP	0	0	0
MS + 2 mg·L-1 BAP	0	0	0
MS + 2.5 mg·L-1 BAP	0	0	0
MS + 3 mg·L-1 BAP	0	0	0
MS + 3.5 mg·L-1 BAP	0	0	0
MS + 4 mg·L-1 BAP	0	0	0
MT + 1 mg·L-1 BAP	63	0	0
MT + 2 mg·L-1 BAP	82	0	0
MT + 2.5 mg·L-1 BAP	85	0	0
MT + 3 mg·L-1 BAP	85	0	0
MT + 3.5 mg·L-1 BAP	33	37	0
MT + 4 mg·L-1 BAP	0	0	0

 

Sự thay đổi của mô trong suốt quá trình nuôi cấy được quan sát bằng kính hiển vi soi nổi hai mắt (Nikos SMZ-2T) và dữ liệu hình ảnh đã được chụp bằng Nikon Coolpix 4500 và Nikon D300 với ống kính Mikro Nikkor 60mm. Mẫu được thu nhận tại các giai đoạn phát triển khác nhau để chuẩn bị cho các đánh giá vi thể.
 

Phân tích thống kê: Hai mươi mẫu được sử dụng cho mỗi nghiệm thức. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ tạo mô sẹo, chồi ngọn và rễ (phần trăm số mẫu hình thành các mô sẹo, chồi ngọn và rễ) được ghi nhận sau 3 tháng nuôi cấy.
 

Phân tích vi thể: Mẫu lá được thu nhân tại các ngày 0 (đối chứng), 7, 8, 17 tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy và chuẩn bị để quan sát dưới kính hiển vi quang học (LM). Mẫu được cắt thành những đoạn nhỏ và được cố định ngay lập tức bằng 4% (w/v) paraformaldehyde và 0.1% (w/v) glutaraldehyde trong dung dịch đệm phosphate 0.1 M (PBS; pH = 7.2) khoảng 30 phút (3x10 phút), sau đó rửa lại ba lần với dung dịch đệm phosphate (PBS; pH = 7.2) và làm bay hơi nước với một loạt các nồng độ ethanol. Tiếp tục tẩm mẫu trong hỗn hợp gồm LR White resin (LRW) và ethanol tuyệt đối (tỷ lệ v/v 1:3, 1:1, 3:1; mỗi hỗn hợp ngâm trong vòng 1 giờ), để qua đêm (12 giờ) trong 100% LRW và để thêm 8h cũng trong 100% LRW. Cuối cùng, các đoạn mẫu được lồng vào vỏ nang gelatin và để polimer hóa khoảng 24h tại 50°C. Các mô được cắt lát siêu mỏng (1.5 μm) với thiết bị vi phẫu (Reichert Ultracut S) và nhuộm với 1% toluidine blue. Các dữ liệu vi thể thu được bằng kính hiển vi Nikon Eclipse Ni với camera Nikon DS-Qi1Mc.
 

Khả năng tái sinh của Citrus limon L. Burm cv. ‘Primofiore’ được khảo sát từ hạt khô. Sau khi khử trung bề mặt, các hạt giống (Hình 1A) được chuyển sang môi trường MS (Hình 1B). Sau 45 ngày nuôi cấy, cây non hình thành (Hình 1C) và được sử dụng trong các giai đoạn tiếp theo của quá trình tái sinh in vitro. Các mẫu lá (Hình 1D) được nuôi cấy trong các đĩa petri với môi trường MS và MT bổ sung với các tổ hợp khác nhau của chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Sau 80 ngày nuôi cấy trên môi trường MT bổ sung 3.5 mg/L BAP, hình thành mô sẹo màu kem trên bề mặt mẫu (Hình 1E). Sau 7 ngày tiếp theo, xuất hiện các phần mô sẹo phát triển tốt (Hình 1F) và thêm 7 ngày nữa quan sát được quá trình caulogenesis (phát sinh thân, hay phát sinh chồi ngọn từ mô sẹo) trên bề mặt của mẫu (Hình 1G). Các chồi ngọn non này sẽ được tiếp tục phát triển đến giai đoạn sẵn sàng ra rễ (Hình 1). Các cây con có vài lá (hình 2A) được chuyền vào môi trường ra rễ (Hình 2B). Việc tái sinh mô sẹo quan sát thấy được ở đa số các nồng độ BAP đã thử nghiệm trên môi trường MT (Hình 3C) nhưng chỉ có một nồng độ gây phát sinh cơ quan.
 

Sau 60 ngày nuôi cấy mẫu trên môi trường MS có bổ sung nhiều nồng độ BAP khác nhau, chỉ quan sát thấy sự phân hủy mẫu mà không có dấu hiệu của quá trình tái sinh.
 

Đối với mẫu nuôi cấy trên môi tường MS có bổ sung phức hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: 5mg/L kết hợp 1mg/L NAA; 1mg/L kinetin kết hợp 1mg/L NAA chỉ quan sát thấy quá trình tạo rễ (rhizogenesis) sau 60 ngày.

Hình 1: Tái sinh in vitro của cây Citrus limon L. Burm cv. ‘Primofiore’. (A): Hạt đã thu và làm khô từ trái chanh chín; (B): Các hạt giống Citrus limon trong môi trường MS cơ bản; (C): Cây chanh con sau 45 ngày nuôi cấy; (D): Mẫu lá nuôi cấy trên môi trường MT; (E–H): Chồi ngọn phát triển trên mẫu lá trong môi trường MT có bổ sung 3.5mg/L BAP sau 80 ngày (E), 87 ngày (F), 94 ngày (G) và 101 ngày (H) nuôi cấy; Kích thước thanh ngang (A) =1 cm, (B-C) =2 cm, (D) =5 mm, (E) =1 mm, (F–G) =2 mm, (H) =5 mm.

 

Hình 2. Tái sinh in vitro cây Citrus limon L. Burm cv. ‘Primofiore’. (A–B): Các chồi ngọn nhỏ đã tái sinh sau khi chuyền sang môi trường tạo rễ (B); Kích thước thanh ngang (A) =5mm, (B) = 1 cm.

Hình 3: Tái sinh in vitro cây Citrus limon L. Burm cv. ‘Primofiore’. (A). Mẫu nuôi cấy đã tạo rễ trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L kinetin và 1mg/L NAA sau 60 ngày; (B) Mẫu tạo mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.2 mg/L kinetin và 1mg/L NAA sau 60 ngày nuôi cấy; (C) Mô sẹo trên môi trường MT có bổ sung 2mg/L BAP sau 80 ngày nuôi cấy; (D). Phát sinh cơ quan gián tiếp trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L NAA sau 88 ngày nuôi cấy; Kích thước thanh ngang (A–D) =5mm.

 

Sau 60 ngày, các mẫu lá nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung tổ hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác như kinetin 0.2mg/L kết hợp 1mg/L NAA; 1mg/L kinetin kết hợp 1mg/L 2,4-D thu được các mô sẹo màu vàng kem (Hình 3B). Sau 14 ngày nuôi cấy tiếp theo, quan sát thấy các chồi ngọn mới tái sinh trên môi trường MT bổ sung 0.2mg/L KIN kết hợp 1mg/L NAA (Hình 3D).
 

Các nồng độ khác nhau của chất điều hòa tăng trưởng thực vật tác động lên sự hình thành mô sẹo, chồi ngọn và rễ của cây Citrus limon L. Burm cv. 'Primofiore' được đưa ra trong Bảng1.
 

Phân tích vi thể mô lá của cây Citrus limon nuôi cấy in vitro khi có những dấu hiệu bắt đầu tái sinh. Vào thời điểm lấy mẫu (ngày 0), các lá C. limon cho thấy cách bố trí điển hình của mô lá (Hình 4A). Cấu trúc giải phẫu của lá có các đặc trưng của mô non, các tế bào có kích thước và hình dạng tương tự nhau đồng thời gắn chặt với nhau. Sau 7 ngày nuôi cấy, mặt cắt ngang của mẫu lá đã cho thấy số lượng tế bào mới phân chia tăng lên, đặc biệt ở lục mô xốp (Hình 4B). Cấu trúc giải phẫu bên trong phiến lá trong những ngày nuôi cấy tiếp theo có những thay đổi không đáng kể, nghĩa là ít nhìn thấy sự khác biệt giữa mô dậu và lục mô xốp. Khi lá phát triển, các tế bào nhu mô của tất cả các lớp trở nên giống nhau. Chúng có hình cầu, gia tăng kích thước và hầu hết đều chứa đầy một lượng lớn tế bào chất (Hình 4C). Trong suốt những ngày nuôi cấy sau đó, có sự gia tăng đáng kể về kích thước và hình dạng tế bào, đặc biệt là trong lớp mô dậu của diệp nhục. Song song với điều này là dẫn đến sự phát triển chắc chắn của mô bên trong bó mạch, trong đó chúng tôi đã quan sát được một số tế bào sau phân chia. Trong quá trình nuôi cấy mẫu lá trên các môi trường, các mô có sự gia tăng kích thước đáng kể (hình 4D). Sự gia tăng này là do sự phân chia và lớn lên của tế bào. Sự tăng sinh và phát triển của nhiều tế bào được quan sát thấy trong mẫu lá tại 2 và 3 tuần trên môi trường nuôi cấy. Rất có thể, quá trình tái sinh cơ quan bắt đầu tại thời điểm này.
 

Việc tái sinh các loài Citrus là một quá trình chậm (Singh và Rajam 2009). Quá trình tạo mô sẹo và phát sinh cơ quan của C. limon cần kéo dài và gặp nhiều khó khăn hơn so với các loài thảo mộc (Kalinina và Brown 2007, Benabdesselam và cộng sự 2011). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thử nghiệm 16 nồng độ và tổ hợp khác nhau của các chất điều hòa tăng trưởng, đồng thời sử dụng 2 loại môi trường nuôi cấy khác nhau để cảm ứng tạo mô sẹo. Thêm vào môi trường MT 50g/L sucrose dường như kích thích việc tái sinh của C. limon. Nhưng đối với loài Citrus khác, ví dụ như Citrus assamensis, việc bổ sung 30g/L và pH 5.8 sẽ tốt hơn cho quá trình tái sinh, như báo cáo gần đây của Yaacob và cộng sự (2014).
 

Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc tạo mô sẹo đã diễn ra trên 8 tổ hợp môi trường nuôi cấy khác nhau. Môi trường MT bổ sung 3.5mg/L BAP là môi trường cung cấp tốt nhất cho quá trình tạo chồi ngọn. Nồng độ BAP lớn hơn 3.5mg/L không cảm ứng phát sinh mô sẹo và hình thành chồi ngọn. Kết quả của chúng tôi thu được tương tự với kết quả của Almeida và cộng sự (2002) và đã xác nhận rằng nồng độ BAP cao sẽ không cải thiện quá trình tài sinh cơ quan.
 

Việc tạo rễ cho cây con được cảm úng trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L NAA. Tác động tích cực của riêng NAA hoặc kết hợp với các auxin khác trong việc tạo rễ in vitro cũng đã được nghiên cứu bởi một số tác giả (Mukhtar và cộng sự 2005a, Saini và cộng sự 2010). Đối với một số loài khác như C. limonia, C. sinensis, và C. jambhiri việc thêm các auxin khác như IBA (indole-3-butyric acid) hoặc IAA (indole-3-acetic acid) vào môi tường MS hoặc MT sẽ kích thích tạo rễ (Almeida và cộng sự 2002, Singh và Kaur 2011). Sử dụng kết hợp IBA, NAA và BAP cũng tạo rễ in vitro cho cây C. reticulata và C. limon (Singh và cộng sự 1994).
 

Vai trò quan trọng của BAP trong việc tạo chồi ngọn đối với các loài Citrus cũng được chứng minh bởi một số nhà khoa học (Saini và cộng sự 2010, Rattanpal và cộng sự 2011), trong đó sự tái sinh được quan sát thấy khi có sự hiện diện của BAP riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất điều hòa tăng trưởng khác. Trong trường hợp cây C. aurantifolia, C. sinensis và C. jambhiri việc tạo chồi ngọn thu được trên môi trường MS bổ sung với nhiều nồng độ BAP khác nhau (Rattanpal và cộng sự 2011). Việc thêm BAP vào môi trường nuôi cấy là yêu cầu cần thiết cho việc tạo chồi ngọn của C. clementina (Lombardo và cộng sự 2011). Đối với C. reticulata và C. limon, kết hợp ba chất điều hòa tăng trưởng: BAP (1.0mg/L), kinetin (0.50mg/L) và NAA (0.50mg/L) cho kết quả nhân chồi tốt nhất khi sử dụng đỉnh chồi ngọn của cây 5 đến 6 tuổi làm mẫu cấy (Singh và cộng sự 1994). Cây C. reticulata phát sinh chồi ngọn trên môi trường MS có BAP; tuy nhiên, các kết quả tốt hơn quan sát thấy trên môi trường MT có bổ sung các nồng độ BAP khác nhau, điều này giống với kết quả của chúng tôi (Mukhtar và cộng sự 2005 A, Ali và Mirza 2006). Sự phát sinh chồi ngọn của C. limon từ các mắt ngủ thu được trên môi trường MS chứa 2mg/L BAP và 2mg/L GA3, nhưng số lượng chồi cao nhất thu được khi sử dụng 2 mg/L BAP (Sarma và cộng sự 2011).
 

Gần đây, các tác nhân gây bệnh trên cây Citrus như nấm, vi khuẩn và virus đã kháng thuốc và ngày càng phổ biến, điều này làm vấn đề kiểm soát bệnh hại trong quá trình phát triển của cây trồng gặp nhiều khó khăn hơn. Chắc chắn một điều rằng các sản phẩm bảo vệ thực vật nhằm diệt nấm hoặc diệt khuẩn hiện nay không hề quan tâm đến sức khoẻ con người. Nhờ các điều kiện vô trùng khi mô sẹo và cây con phát triển, các phương pháp in vitro cho phép tránh nhiễm hoặc loại bỏ các mầm bệnh từ những bước đầu tiên và quan trọng nhất trong việc nhân giống Citrus. Do đó, việc vi nhân giống có thể sử dụng như một biện pháp khắc phục các bệnh khác nhau của nhiều giống Citrus limon và có thể hữu ích trong việc tạo ra nhiều giống cây kháng bệnh. Đây cũng có thể là một phương pháp hỗ trợ cho các nhà khoa học trong nỗ lực tạo các giống mới của các loài Citrus, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của người nông dân và người tiêu dùng. Các kết quả thu được trong bài báo này có thể là cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về quy trình vi nhân giống các giống C. limon có giá trị. Chúng cũng có thể được sử dụng làm cơ sở cho các nghiên cứu nhằm mục đích bảo tồn các giống cây Citrus lâu đời đã bị loại bỏ vì những yêu cầu mới về chất lượng trái của nông dân và người tiêu dùng.
 

Trong nghiên cứu này một quy trình in vitro được thiết lập từ mẫu lá của cây giống C. limon. Việc tái sinh trong chi Citrus có thể thu được thông qua phát sinh cơ quan trực tiếp hoặc gián tiếp sử dụng mẫu lá, đã được trình bày kỹ trong nghiên cứu này. Cảm ứng tạo chồi ngọn tốt nhất trên môi trường MT được bổ sung 3.5mg/L BAP. Điều này cũng chứng minh rằng BAP có một ảnh hưởng lớn đến quá trình nhân chồi ngọn đối với cây C. limon. Rễ cây C. limon tạo được bằng cách sử dụng môi trường MS chứa 1mg/L NAA.
 

Ali S., Mirza B. (2006). Micropropagation of rough lemon (Citrus jambhiri Lush.): Effect of explants type and hormone concentration. Acta Bot. Croat., 65(2), 137–146.

Almeida, W.A.B., Mourão Filho, F.A.A., Mendes, B.M.J., Rodriguez, A.P.M. (2002). In vitro organogenesis optimization and plantlet regeneration in Citrus sinensis and C. limonia. Sci. Agric., 59, 35–40.

Ashok Kumar, K., Narayani, M., Subanthini, A., Jayakumar, M. (2011). Antimicrobial activity and phytochemical analysis of citrus fruit peels – utilization of fruit waste. Internat. J. Engin. Sci. Technol., 3(6), 5414–5421.

Bansode, D.S., Chavan, M.D. (2012). Studies on antimicrobial activity and phytochemical analy- sis of Citrus fruit juices against selected enteric pathogens. Internat. Res. J. Pharm., 3(11), 122–126.

Benabdesselam, F.M., Khettal, B., Bedjou, F. (2011). Micropropagation of Algerian juvenile rootstocks Citrus species. Life Sci. Leaf., 18, 707–717.

Carimi, F., De Pasquale, F., Crescimanno, F.G. (1994). Somatic embryogenesis from styles of lemon (Citrus limon L. Burm). Plant Cell Tiss. Org. Cult., 37, 209–211.

Dhanavade, M.J., Jalkute, C.B., Ghosh, J.S., Sonawane, K.D. (2011). Study antimicrobial activity of lemon (Citrus lemon L.) peel extract. Brit. J. Pharm. Toxic., 2(3), 119–122.

FAO (2001). http://apps.fao.org/lim500/nph-wrap.pl.

Foschi, R., Pelucchi, C., Dal Maso, L., Rossi, M., Levi, F., Talamini, R., Bosetti, C., Negri, E., Serraino, D., Giacosa, A., Franceschi, S., La Vecchia, C. (2010). Citrus fruit and cancer risk in a network of case-control studies. Canc. Caus. Contr., 21(2), 237–242.

Gaurav, K., Richa, S. (2012). In vitro micropropagation of different species of citrus. Res. J. Biotech., 7(4), 96–101.

Kalinina, A., Brown, D.C.W. (2007). Micropropagation of ornamental Prunus spp. and GF305 peach, a Prunus viral indicator. Plant Cell Rep., 26, 927–935.

Lombardo, G., Alessandro, R., Scialabba, A., Sciandra, M., De Pasquale, F. (2011). Direct or- ganogenesis from cotyledons in cultivars of Citrus clementina Hort. Ex Tan. Am. J. Plant Sci., 2, 237–244.

Mukhtar, R., Khan, M.M., Fatima, B., Abbas, M., Shahid, A. (2005a). In vitro regeneration and multiple shoots induction in Citrus reticulata (Blanco). Int. J. Agri. Biol., 7(3), 414–416.

Mukhtar, R., Khan, M.M., Rafiq, R., Shahid, A., Khan, F.A. (2005b). In vitro regeneration and somatic embryogenesis in (Citrus aurantifolia and Citrus sinensis). Int. J. Agri. Biol., 7(3), 518–520.

Murashige, T., Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant., 15, 473–497.

Murashige, T., Tucker, D.P.H. (1969). Growth factor requirements of citrus tissue culture. Inter- nat. Citrus Symp., 1, 1155–1169.

Rattanpal, H.S., Kaur, G., Gupta, M. (2011). In vitro plant regeneration in rough lemon (Citrus jambhiri Lush.) by direct organogenesis. Afr. J. Biotech., 10(63), 13724–13728.

Saini, H.K., Gill, M.S., Gill, M.I.S. (2010). Direct shoot organogenesis and plant regeneration in rough lemon (Citrus jambhiri Lush.). Ind. J. Biotech., 9, 419:423.

Sarma, C., Borthakur, A., Singh, S., Modi, M.K., Sen, P. (2011). Efficient in vitro plant regenera- tion from cotyledonary explants of Citrus reticulata L. Blanco. Ann. Biol. Res., 2(6), 341–348.

Savita, Singh, B., Virk G.S., Nagpal A.K. (2011). An efficient plant regeneration protocol from callus cultures of Citrus jambhiri Lush. Physiol. Mol. Biol. Plants, 17(2), 161–169.

Savita, Vijay, Virk, G.S., Nagpal, A. (2010). Effect of explant type and different plant growth regulators on callus induction and plantlet regeneration in Citrus jambhiri Lush. Environ. We Int. J. Sci. Tech., 5, 97–106.

Singh, B., Kaur, A. (2011). Comparison of agar and gum karaya as gelling agent for in vitro regeneration of rough lemon (Citrus jambhiri Lush.) plantlets from nodal explants. J. Crop Sci. Biotech., 14(4), 297–303.

Singh, S., Rajam, M.V. (2009). Citrus biotechnology: Achievements, limitations and future direc- tions. Physiol. Mol. Biol. Plants, 15(1), 3–22.

Singh, S., Ray, B.K., Bhattacharyya, S., Deka, P.C. (1994). In vitro propagation of Citrus reticu- lata Blanco and Citrus limon Burm. f. HortSci., 29(3), 214–216.

Tusa, N., Grosser, J.W., Gmitter, F.G. (1990). Plant regeneration of ‘Valencia’ sweet orange, ‘Femminello’ lemon and the interspecific somatic hybrid following protoplasm fusion. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 115(6), 1043–1046.

Yaacob, J.S., Mahmad, N., Taha, R.M., Mohamed, N., Yussof, A.I.M., Saleh, A. (2014). Optimi- zation of culture conditions (sucrose, pH, and photoperiod) for in vitro regeneration and early detection of somaclonal variation in ginger lime (Citrus assamensis). The Sci. World J., Arti- cle ID 262710, 1–9

Chấp nhận in: 29.04.2015

Trích dẫn: Kasprzyk-Pawelec, A., Pietrusiewicz, J., Szczuka, E. (2015). In vitro regeneration induced in leaf explants of Citrus limon L. Burm cv. ‘Primofiore’. Acta Sci. Pol. Hortorum Cul- tus, 14(4), 143–153.

Phương Anh
SBC Scientific