Nghiên cứu này báo cáo ảnh hưởng của cao chiết nấm men; chitosan kết hợp với cao chiết nấm men lên sự phát triển, thay đổi hình thái và lượng phenolic trong các cây Curcuma mangga trong điều kiện in vitro. Cao chiết nấm men không có bất kỳ ảnh hưởng nào đến sự phát triển sinh khối và chồi trong điều kiện. Tuy nhiên, khi bổ sung cao chiết nấm men ở nồng độ cao (≥3,5 mgL-1) vào môi trường nuôi cấy, các mẫu cây xuất hiện hình thái bất thường. Các mẫu cây nuôi cấy trong môi trường chứa 3.5 và 5.0 mg/L cao chiết nấm men cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) cao hơn, trong đó cao chiết nấm men có thể gây stress kích thích việc sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp, các chất này sẽ hoạt động như các hợp chất bắt gốc tự do trong phương pháp DPPH (phương pháp sử dụng 1,1- diphenyl-2 picrylhydrazyl). Sinh khối các mẫu C. mangga bị ảnh hưởng khi tiến hành xử lý với các nồng độ chitosan khác nhau kết hợp 3.5 mg/L cao chiết nấm men. Các mẫu cây nuôi cấy trong môi trường bổ sung 150 mg/L chitosan kết hợp với 3.5 mg/L cao chiết nấm men cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) cao hơn đối với DPPH khi so sánh với các nghiệm thức khác. Động học của hoạt tính bắt gốc tự do DPPH từ dịch chiết C. mangga được coi là chậm so với quercetin đồng thời mối tương quan giữa hàm lượng phenolic tổng và RSA kém (R2 = 0.2293) đối với cao chiết nấm men và (R2 = 0.0373) đối với chitosan kết hợp cao chiết nấm men. Điều này chứng tỏ rằng sự có mặt của các hợp chất phenolic trong dịch chiết C. mangga không phải là yếu tố chính góp phần vào khả năng chống oxi hóa của cây này. 
 

Từ khóa: Curcuma mangga, in vitro, chất cảm ứng, các hợp chất phenolic, hoạt tính chống oxy hóa.

 

Họ Gừng (họ Zingiberaceae) được biết đến với nhiều mục đích sử dụng khác nhau, từ thực phẩm đến y dược. Trong đó, loài nghệ Curcuma mangga Val. Là một trong những loài quan trọng nhất thuộc họ này, đây là loài bản địa của vùng Nam Á (Larsen và cộng sự., 1999). Nó được biết dưới tên Temu Pauh tại Malaysia, Temu Mangga tại Indonesia và Mango Turmeric tại Ấn Độ, mang tên Mango (Xoài) vì rễ tươi của chúng có mùi xoài. Đã có các báo cáo cho rằng rễ của cây C. mangga có đặc tính chống ung thư và chống oxy hoá (Abas và cộng sự, 2005; Chan và cộng sự, 2008). Các nghiên cứu cũng cho thấy lá C. mangga có hàm lượng phenol tổng và hoạt tính bắt gốc tự do cao hơn phần rễ (Chan và cộng sự, 2008). Do đó cần có các nghiên cứu sâu hơn để thu được nhiều hơn các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ lá. Khả năng chống oxy hóa cao chủ yếu được tìm thấy trong các cây C. ganga trưởng thành và thông thường phải mất một thời gian dài để cây trưởng thành. Hơn nữa, việc nhân giống cây này bằng các phương pháp thông thường phải phụ thuộc vào mùa. Điều này dẫn đến tình trạng thiếu vật liệu thực vật để sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học chống oxy hoá. Nhìn chung, hầu hết thực vật sản xuất một lượng rất nhỏ các hợp chất chuyển hóa thứ cấp và thường chỉ diễn ra trong một số trường hợp nhất định. Do đó, các kỹ thuật nuôi cấy in vitro có thể là những lựa chọn thay thế giúp tăng cường sản xuất sinh khối thực vật mà không phụ thuộc vào mùa. Trong nuôi cấy mô thực vật, có thể làm tăng sự tích tụ các chất chuyển hóa thứ cấp thông qua việc xử lý với các tác nhân kích thích khác nhau, có thể là hợp chất sinh học và phi sinh học. Các nghiên cứu trước đây cho thấy việc tích tụ các hợp chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau có thể được cảm ứng hiệu quả bởi các chất kích thích (Ekiert và Gomolka, 2000; Ekiert, 2001). Cao chiết nấm men và chitosan đã được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật do khả năng gây cảm ứng cơ chế bảo vệ, dẫn đến tăng cường sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp. Do đó, nghiên cứu này báo cáo ảnh hưởng của cao nấm men và chitosan lên (i) sinh khối và hình thái của cây C. mangga in vitro, (ii) hoạt tính chống oxy hoá và hàm lượng phenolic tổng của cây C. mangga in vitro.
 

Thiết lập nuôi cấy invitro
 

Mẫu cấy được sử dụng là các chồi thân rễ non, rửa kỹ mẫu dưới vòi nước máy trong 40 phút để loại bỏ các chất ô nhiễm đất. Các mẫu chồi con (1.5cm) được ngâm trong ethanol 70% khoảng vài phút, sau đó khử trùng bề mặt trong 20 phút với Clorox® 20%, một chất tẩy rửa thương mại chứa 5.3% sodium hypochlorite. Các mẫu sau khi khử trùng được rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Tiếp tục cấy các mẫu này lên môi trường Murashige và Skoog (1962) (MS) trong ba tuần và các cây con vô trùng phát sinh từ các mẫu này sẽ được sử dụng để nhân chồi sau đó. Các mẫu chồi in vitro này được chuyền vào môi trường MS có bổ sung 6-benzylaminopurine (BA) 2 mg/L và 1-naphtalene acetic acid (NAA) 0.5 mg/L, một môi trường nhân chồi cho cây Curcuma amada của Prakash và cộng sự. (2004). Các chồi C. mangga nuôi cấy in vitro được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

 

Các nghiệm thức xử lý
 

Cao chiết nấm men
 

Mỗi chồi được cắt làm hai phần theo chiều dọc, mỗi phần được xem như một mẫu thử nghiệm. Cứ ba mẫu thử nghiệm được cấy vào một erlen 250ml chứa 60 ml môi trường MS lỏng bổ sung BA (2mg/L), NAA (0.5mg/L) và các nồng độ khác nhau của cao chiết nấm men (0, 0.5, 2.0, 3.5 và 5.0 mg/L). Các mẫu in vitro được xủ lý với 3.5 mg/L cao chiết nấm men cho kết quả tốt, vì vậy nồng độ này được sử dụng kết hợp vào các thí nghiệm tiếp theo.

Kết hợp Chitosan và cao chiết nấm men
 

Ba mẫu thử nghiệm (một phần chồi cắt theo chiều dọc) được cấy vào mỗi erlen 250 mL có chứa môi trường MS lỏng bổ sung BA (2mg/L) và NAA (0.5mg/L), đây môi trường phát triển chồi. Dung dịch mẹ (1g/L chitosan) được sử dụng để chuẩn bị các nồng độ cuối 50, 100, 150, 200mg/L trong môi trường thí nghiệm. Nồng độ tối ưu (3.5 mg/L) của cao chiết nấm men được thêm vào mỗi môi trường
 

Điều kiện nuôi cấy
 

Tất cả các erlen chứa mẫu cấy (cả nghiệm thức cao chiết nấm men và chitosan kết hợp với cao chiết nấm men) được lắc trên máy lắc tròn (SK 600 Lab. Companion, Korea) ở tốc độ 80 vòng/phút đặt trong phòng tại 25±2oC, dưới ánh sáng liên tục với cường độ 35μmol/m2/s
 

Đo lường
 

Sinh khối tươi (khối lượng) và số lượng chồi tạo ra từ mỗi mẫu được xác định sau 4 tuần nuôi cấy, sinh khối khô cũng được xác định khi sấy mẫu đến khối lượng không đổi. Các đặc điểm hình thái của cây in vitro cũng được ghi nhận.

Thiết kế thí nghiệm và phân tích thống kê
 

Bảy đơn vị thí nghiệm sử dụng cho nghiệm thức cao chiết nấm men và mười đơn vị thí nghiệm cho thử nghiệm cao chiết nấm men kết hợp chitosan, ba mẫu thử nghiệm/đơn vị thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí theo mô hình thiết kế khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD). Dữ liệu được phân tích phương sai hai yếu tố (Two-Way ANOVA) và các giá trị trung bình được so sánh bằng thử nghiệm Tukey tại p≤0.05 sử dụng phần mềm thống kê SPSS ver. 12.0.
 

Xác định hoạt tính chống oxy hóa
 

Chuẩn bị mẫu cao chiết 
 

Mẫu khô được nghiền thành bột bằng máy xay sinh tố, 4 gram mẫu được cho vào erlen 250ml chứa 100ml methanol (độ tinh khiết 99%, AR, Q-REC) và ủ trong bể ủ 40°C khoảng 2 giờ được lắc liên tục ở tốc độ 90vòng/phút. Sau đó, lọc mẫu qua giấy lọc Whatman số 1. Phần cặn tiếp túc chiết lại ba lần với 100ml methanol/lần. Hòa trộn các dịch lỏng của cùng một mẫu và cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không (Eyela N-N Series, Nhật Bản). Các mẫu đã cô đặc được giữ ở 4oC cho các thí nghiệm tiếp theo.
 

Hoạt tính bắt gốc tự do sử dụng 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazil (DPPH)
 

Hoạt tính bắt tự do được xác định bằng phương pháp hiệu chỉnh của Brand-Brand-William và cộng sự, (1995). Dung dịch DPPH 0.3mM đã được chuẩn bị trong methanol và thêm 150μl dung dịch này vào 50μl dịch chiết mẫu thực vật (16mg/ml, DMSO) được đặt trong đĩa 96 giếng ủ ở 37oC. Độ hấp thụ của các mẫu được xác định bằng máy quang phổ (Multiskan Findland) tại bước sóng 515nm sau 30 phút ủ và khoảng 10 phút cho những lần tiếp theo đến khi đạt được giá trị không đổi. Sử dụng quercetin làm đối chứng dương và DMSO làm đối chứng âm. Xác định giá trị EC50, tức nồng độ dịch chiết thực vật có thể làm giảm nồng độ DPPH xuống 50%, chúng tôi chỉ xác định giá trị EC50 cho các mẫu có hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) cao.
 

Xác định hàm lượng phenolic tổng
 

Hàm lượng phenolic tổng trong dịch chiết C. mangga được xác định bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu theo Singleton và cộng sự. (1999) sử dụng axit gallic (Sigma, St Louis USA) làm chất chuẩn. Thuốc thử Folin-ciocalteu (1mL) đã được thêm vào 0.5 mL dịch chiết (1000 mg/L) và trộn đều. Sau 4 phút, thêm 1% natri cacbonat (3mL), và hỗn hợp được ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 760nm so với mẫu trắng (DMSO) sử dụng máy quang phổ (Ultrospec, Malaysia). Dựa trên đường chuẩn gallic acid (từ 0.01 đến 0.25μg/mL) để xác định hàm lượng phenolic tổng, biểu hiện bằng đương lượng acid gallic (μgGAE/mg mẫu cao chiết thực vật).

Cao chiết nấm men
 

Cao chiết nấm men được sử dụng làm chất bổ sung trong môi trường phát triển mà không ảnh hưởng đến sự nhân chồi của các cây 
 

C. mangga in vitro (Bảng 1). Tuy nhiên, các cây con in vitro được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung cao chiết xuất nấm men với nồng độ ≥3,.5 mg/L xuất hiện những dấu hiệu bất thường về hình thái. Các bất thường bao gồm chậm phát triển chồi, hoại tử và ức chế sự phát triển của lá của cây C. mangga in vitro (Hình 1). Những hiện tượng này cũng đã được phát hiện đối với cây Glehnia littoralis in vitro sau khi chúng phơi nhiễm với cao chiết nấm men. Tuy nhiên, việc bổ sung cao chiết nấm men vào môi trường nuôi cấy cây G. littoralis lại làm tăng khả năng sản sinh ra các chất chuyển hóa thứ cấp (Ishikawa và cộng sự, 2007).
 

Bảng 1: Ảnh hưởng của cao chiết nấm men đến sự nhân chồi của cây C. mangga in vitro
 

Bảng 1: Ảnh hưởng của cao chiết nấm men đến sự nhân chồi của cây C. mangga in vitro
Cao chiết nấm men (mg/L)	Số chồi con/mẫu thử nghiệm (1/2 chồi mẫu) ± độ lệch chuẩn
0	4.7 ± 0.6a
0.5	4.4 ± 0.7a
2.0	3.9 ± 0.6a
3.5	4.2 ± 0.5a
5.0	4.4 ± 0.4a
Các giá trị trung bình trong cùng cột được theo sau bởi các chữ cái giống nhau cho thấy sự khác biệt không đáng kể (kiểm định Tukey, p ≤ 0.05)

 

Trước đây, cao chiết nấm men được sử dụng làm chất dinh dưỡng tăng trưởng trong nuôi cấy mô bệnh khối u (crown-gall tissue) và nuôi cấy mô sẹo (Jonard, 1960; Vasil và Hildebrandt, 1966). Hiện nay, cao chiết nấm men thường được sử dụng như một chất kích thích sinh học nhằm cảm ứng và tăng cường sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp. Các báo cáo đã đề nghị sử dụng cao chiết nấm men như chất bổ sung để thúc đẩy sự phát triển của cây, vì chúng có hàm lượng amino acid cao (George và cộng sự, 2008). Tuy nhiên, các loài khác nhau sẽ có những cách đáp ứng khác nhau đối với sự hiện diện của cao chiết nấm men, khi bổ sung nồng độ cao vào môi trường MS gây ức chế sự phát triển trong khi nồng độ thấp của cao nấm men lại có tác dụng tốt hơn (Vasil và Hilderbrandt, 1966). 

Các nghiên cứu của Guo và Ohta (1994) đã chỉ ra rằng cao nấm men tăng cường sự tích lũy 
 

6-methoxymellein đối với tế bào cà rốt, trong khi Zhao và cộng sự (2004) báo cáo rằng nuôi cấy tế bào Cupressus lusitanica đã xử lý với cao nấm men giúp tăng cường sự tích tụ và chuyển hóa polyphosphoinositol. Kết quả trong nghiên cứu này cũng cho thấy cao nấm men không hoạt động như một chất dinh dưỡng khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy vì chúng không thúc đẩy sự phát triển của cây con 
 

C. mangga. Tuy nhiên, môi trường nuôi cấy có bổ sung cao nấm men gây ra các bất thường về hình thái. Điều này có thể là kết quả khi đáp ứng lại các căng thẳng của cây con bị gây ra bởi sự tích tụ các chất chuyển hóa thứ cấp do hoạt động kích thích của cao nấm men. Kết quả cũng cho thấy việc bổ sung cao nấm men vào môi trường nuôi cấy làm tăng hàm lượng phenolic tổng, nhưng chỉ bổ sung đến một mức độ nhất định (3.5mg/L) (Hình 2). Lượng cao nấm men cao hơn (5.0 mg/L) không kích thích hoạt động sản sinh các hợp chất phenolic mà thay vào đó kìm hãm sự tăng trưởng, như đã được chứng minh bằng sự phát triển chậm của cây C. mangga khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh có bổ sung 5.0mg/L cao nấm men (Hình 1). Tuy nhiên, cao nấm men không ảnh hưởng đến sinh khối tươi và khô của cây (Hình 2). Do đó, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng cao chiết nấm men không hoạt động như một chất bổ sung dinh dưỡng cho sự phát triển của cây C. mangga in vitro nhưng với lượng tối ưu có thể giúp tăng cường sản sinh các hợp chất phenolic. Đã có báo cáo rằng cao nấm men không ảnh hưởng đến con đường sinh tổng hợp của thực vật. Tuy nhiên, nó kích hoạt việc sản xuất jasmonic acid và/hoặc methyl jasmonate nội sinh, hai chất có ảnh hưởng đến quá trình sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp (Sanchez-Sampedro và cộng sự, 2005). Sự tăng dần hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) và hàm lượng phenolic tổng (TPC) của cây C. mangga cho thấy cao nấm men có thể kích hoạt sản xuất jasmonic acid và/hoặc methyl jasmonate nội sinh giúp tăng cường sản xuất các hợp chất phenolic trong cây C. mangga.
 

Chitosan kết hợp cao nấm men
 

Việc bổ sung các nồng độ chitosan khác nhau cùng với 3.5 mg/L cao nấm men trong môi trường tăng sinh có ảnh hưởng đáng kể đến sinh khối. Sinh khối chồi giảm khi lượng chitosan được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tăng lên (Hình 3). Bổ sung chitosan cùng với 3.5 mg/L cao nấm men không ảnh hưởng đến quá trình nhân chồi in vitro của C. mangga (Bảng 2). Những bất thường về hình thái của cây con có thể được phát hiện trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chitosan ≥100 mg/L kết hợp với 3.5 mg/L cao nấm men (Hình 4). Các kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở cây Vitis vulgaris khi nồng độ chitogel (dung dịch chitosan) cao hơn làm chậm phát triển (Barka và cộng sự, 2004). Jeong và Park (2005) cũng báo cáo rằng nồng độ chitosan và các oligomer của nó cao hơn làm giảm sinh khối của cây sâm Panax ginseng nhưng tăng cường sản xuất ginseng saponin. Tương tự, nồng độ chitosan cao hơn ức chế sự phát triển khi nuôi cấy rễ tơ của cây Artemisia annua (Putalun và cộng sự., 2007) và Brugmansia candida (Pitta-Alvarez và Giulietti, 1999). Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy khi bổ sung chitosan đến một mức độ nhất định (150 mg/L) kết hợp với 3.5 mg/L cao nấm men vào môi trường nuôi cấy làm giảm hàm lượng phenolic trong cây C. mangga (Hình 3). Các nhà nghiên cứu cũng cho rằng không có một ảnh hưởng chung đối với các loài thực vật khác nhau khi sử dụng cùng một chất kích thích. Ngoài ra, cũng rất khó để dự đoán rằng một tác nhân kích thích sẽ có ảnh hưởng thế nào đến sự tích tụ chất chuyển hóa trong cùng một hệ thống tế bào. Các đáp ứng khi bị kích thích của mẫu thực vật còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ như giai đoạn tăng trưởng của mẫu cấy tại thời điểm kích thích và thời gian tiếp xúc với chất kích thích (Bhagwath và Hjorts, 2000). 
 

Bảng 2: Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với cao nấm men đến sự nhân chồi của cây C. mangga trong in vitro
Cao chiết nấm men (mg/L)	Chitosan (mg/L)	Số chồi con/mẫu thử nghiệm (1/2 chồi mẫu) ± độ lệch chuẩn
0	0	4.4 ± 1.0a
3.5	0	3.9 ± 1.1ab
3.5	50	3.8 ± 0.9ab
3.5	100	3.6 ± 0.8ab
3.5	150	3.1 ± 0.9b
3.5	200	3.2 ± 0.8ab
Các giá trị trung bình trong cùng cột được theo sau bởi các chữ cái giống nhau cho thấy sự khác biệt không đáng kể (kiểm định Tukey, p ≤ 0.05)

Hình 1: Ảnh hưởng của cao nấm men đến hình thái của cây C. mangga in vitro. (A) 0mg/L; (B) 0.5mg/L; (C) 2.0mg/L; (D) 3.5mg/L và (E) 5.0mg/L cao nấm men trong môi trường tăng sinh

 

Hình 2: Ảnh hưởng của cao nấm men đến sinh khối (khối lượng tươi và khô) và hàm lượng phenolic tổng của cây C. mangga in vitro. 


 

Hình 3: Ảnh hưởng của chitosan + 3.5mg/L cao nấm men đến sinh khối (khối lượng tươi và khô) và hàm lượng phenolic tổng của cây C. mangga in vitro 

Hình 4: Ảnh hưởng của các nồng độ chitosan và cao nấm men đến hình thái của cây C. mangga in vitro. (A) 0mg/L chitosan + 0mg/L cao nấm men; (B) 0mg/L chitosan + 3.5mg/L cao nấm men; (C) 50mg/L chitosan + 3.5mg/L cao nấm men; (D) 100mg/L chitosan + 3.5mg/L cao nấm men; (E) 150mg/L chitosan + 3.5mg/L cao nấm men và (F) 200mg/L chitosan + 3.5mg/L cao nấm men.

 

Hoạt tính kháng oxy hóa của cây C. mangga in vitro
 

Các gốc tự do DPPH có độ nhạy khác nhau với các chất chống oxy hoá. Tùy vào thời gian đạt tới trạng thái ổn định khi bắt các gốc tự do DPPH mà các chất chống oxy hoá được xem là chất có tốc độ phản ứng nhanh (1 phút), trung bình (30 phút) hoặc chậm (1 đến 6 giờ) với gốc tự do DPPH (Brand-William và cộng sự, 1995). C. mangga biểu hiện có tốc độ phản ứng chậm đối với các gốc tự do DPPH vì phải mất 80 phút để đạt được trạng thái ổn định so với quercetine, chất đối chứng này đạt trạng thái ổn định trong vòng 30 phút. Cao chiết thu được từ mẫu đã xử lý với cao nấm men cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do mạnh hơn so với mẫu đối chứng âm (không xử lý với cao nấm men) tại tất cả thời gian ủ mẫu (Hình 5). Điều này chứng tỏ rằng các mẫu được xử lý với cao nấm men có chứa nhiều tác nhân chống oxy hoá hơn. Các mẫu chỉ xử lý với 3.5mg/L cao nấm men cho giá trị EC50 thấp nhất là 2028.50μg. Kết quả này cho thấy việc bổ sung chitosan tại các nồng độ khác nhau kết hợp 3.5 mg/L cao nấm men làm tăng đáng kể hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) trong thời gian ủ 30 phút so với mẫu đối chứng (chitosan 0; 0) và các xử lý với chitosan khác. Bổ sung 150mg/L chitosan và 3.5mg/L cao nấm men cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) cao nhất so với các nồng độ chitosan khác (Hình 5) với giá trị EC50 là 1844,48μg.
 

Mối tương quan giữa hoạt tính bắt gốc tự do và hàm lượng phenolic tổng
 

Các hợp chất phenolic có trong thực vật là một trong những nhóm chính của các hợp chất có hoạt tính chống oxy hoá hoặc bắt gốc tự do (Sanchez-Moreno và cộng sự, 1998). Về mặt lý thuyết, hàm lượng phenolic cao sẽ có hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) cao hơn. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, không có mối tương quan trực tiếp giữa hàm lượng phenolic tổng và hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) của mẫu cao chiết từ cây C. mangga thu được khi xử lý với cao nấm men (R2=0.2293) và chitosan kết hợp cao nấm men (R2=0.0373) (Hình 6). Điều này có thể là do các phenolic dạng liên kết trong các mẫu cao chiết từ C. mangga không có hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) trong phương pháp DPPH, do đó không có mối tương quan giữa hàm lượng phenolic và hoạt tính chống oxy hóa.
 

Để kiểm tra mối tương quan giữa hàm lượng phenolic tổng và hoạt tính bắt gốc tự do (RSA), hoạt tính này được quan sát sau 120 phút ủ, đây là thời điểm mà phản ứng được xem là đạt đến trạng thái ổn định cuối cùng. Mặc dù vậy, mối tương quan giữa hàm lượng phenolic tổng và và hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) là rất thấp. Điều này đã gián tiếp xác nhận rằng các hợp chất phenolic không phải là yếu tố chính góp phần vào đặc tính chống oxy hóa của 

C. mangga. Có thể có nhiều hợp chất khác và các tương tác phức tạp của chúng chịu trách nhiệm cho hoạt tính chống oxy hóa của 
 

C. mangga. Amakura và cộng sự (2000) cũng báo cáo rằng mối tương quan giữa hàm lượng phenolic tổng và hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) của các loài quả mọng khác nhau sẽ có sự khác nhau. Kết quả cũng cho thấy hai loại quả có mối tương quan đáng kể giữa hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) và phenolic tổng với hệ số tương quan R đạt 0.95 đến 0.97, trong khi ba loại quả có giá trị R giữa 0.57 và 0.72 và 4 loại khác có R từ 0.3 đến 0.78.

Phương pháp DPPH được xem là một trong những phương pháp đơn giản nhất để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa.
 

Tuy nhiên, phương pháp thử nghiệm khả năng chống oxy hóa khác lại cho kết quả khác vì mỗi phương pháp có cơ chế phản ứng riêng. Cơ chế chung của quá trình chống oxy hóa là chuyển giao nguyên tử hydrogen. Trong khi DPPH là một gốc nitơ bền, không như các gốc peroxyl không bền và có hoạt tính cao liên quan đến quá trình peroxide hóa lipid. Nhiều hợp chất dễ phản ứng với các gốc peroxyl lại có thể không hoặc chậm phản ứng với DPPH (Huang và cộng sự, 2005). Mặc dù nghiên cứu này có những hạn chế, nhưng đã gián tiếp minh chứng các hợp chất phenolic không góp phần vào cơ chế chống oxy hóa của C. mangga thông qua phương pháp DPPH và xác định hàm lượng phenolic tổng.

Hình 5. Động học hoạt tính bắt gốc tự do của cao chiết C. mangga từ mẫu xử lý với (A) cao nấm men và (B) chitosan kết hợp với 3.5 mg/L cao chiết nấm men.

Hình 6. Đồ thị phân tán thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng phenolic tổng (µgGAE/mg cao chiết từ mẫu) và hoạt tính bắt gốc tự do (RSA) của cây C mangga in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung (A) cao nấm men và (B) chitosan + 3.5 mg/L cao chiết nấm men.

Dựa trên nghiên cứu này, có thể kết luận rằng cao chiết nấm men có thể được sử dụng như là chất kích thích sản sinh các hợp chất phenolic trong cây C. mangga trong điều kiện in vitro. Môi trường bổ sung 3.5 và 5.0mg/L cao nấm men cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do cao hơn, điều này được chứng minh khi mẫu thực vật đáp ứng với stress (biến dị hình thái) gây ra bởi cao nấm men bằng việc kích thích sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp, các chất này sẽ hoạt động như hợp chất bắt gốc tự do trong phương pháp DPPH. Chitosan kết hợp với cao nấm men hoạt động như tác nhân kìm hãm sự phát triển và ức chế sản sinh phenolic. Cả hai đều gây ra các bất thường về hình thái khi sử dụng ở nồng độ cao hơn.

Tác giả xin cám ơn Đại học Khoa học Malaysia đã hỗ trợ về mặt tài chính và trường Khoa học Sinh học vì các cơ sở nghiên cứu.

Abas F, Lajis NH, Shaari K, Israf DA, Stanslas J, Yusuf UK (2005). A new labdane diterpene glucoside from the rhizomes of Curcuma mangga. J. Nat. Prod. 68: 1090-1093.

Amakura Y, Umino Y, Tsuji S, Tongai Y (2000). Influence of jam processing on the radical scavenging activity and phenolic content in berries. J. Agric. Food Chem. 48: 6292-6297.

Barka E, Eullaffroy P, Clement C, Vernet G (2004). Chitosan improves development and protects Vitis vinifera against Botrytis cinerea. Plant Cell Rep. 22: 608-614.

Bhagwath SG, Hjorts MA (2000). Statistical analysis of elicitation strategies for thiarubrine: A production in hairy root cultures of Ambrosia artemisiifolia. J. Biotechnol. 80: 159-167.

Brand-William W, Cuvelier ME, Berset C (1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Food Sci. Technol. 28: 25-30. Chan EWC, Lim YY, Wong LF, Lianto FS, Wong SK, Lim KK, Joe CE,

Li TY (2008). Antioxidant and tyrosinase inhibition properties of leaves and rhizomes of ginger species. Food Chem. 109: 477-483.

George EF, Hall MA, De Klerk GJ (2008). The Components of Plant Tissue Culture Media II: Organic Additions, Osmotic and pH Effects, and Support Systems. In: George EF, Hall MA, De Klerk GJ (eds), Plant Propagation by Tissue Culture (3rd edition) Springer, The Netherlands, pp. 115-173.

Guo Z, Ohta Y (1994). Effect of ethylene biosynthesis on the accumulation of 6-methoxymellein induced by elicitors in carrot cells. J. Plant Physiol. 144: 700-704.

Huang D, Ou B, Prior RL (2005). Chemistry behind antioxidant capacity assays, J. Agric. Food Chem. 53: 1841-1856.

Ekiert H, Gomolka E (2000). Furanocoumarins in Pastinaca sativa L. in vitro culture. Pharmazie. 55: 618-620.

Ekiert H (2001). Medical plant biochemistry: the Apiaceae family as the example of rapid development. Pharmazie. 55: 561-570.

Ishikawa A, Kitamura Y, Ozeki Y, Watanabe M (2007). Different responses of shoot and root cultures of Glehnia littoralis to yeast extract. J. Nat. Med. 61:30-37.

Jeong GT, Park DH (2005). Enhancement of growth and secondary metabolite biosynthesis: Effect of elicitors derived from plants and insects. Bioprocess Eng. 102:73-77.

Jonard R (1960). Action of indoleacetic acid and yeast extract on restoring the oliferation power of salsify crown-gall tissue cultures which have been X-ray irradiated. C R Seances Acad. Sci. D. 25: 588-590.

Larsen K, Ibrahim H, Khaw SH, Saw LG (1999). Gingers of Peninsular Malaysia and Singapore, Kota Kinabalu, Natural History Publications (Borneo).

Murashige K, Skoog F (1962). A revised medium for the rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15: 473- 497.

Pitta-Alvarez SA, Giulietti AM (1999). Influence of chitosan, acetic acid and citric acid on growth and tropane alkaloid production in transformed roots of Brugmansia candida: effect of medium, pH and growth phase. Plant Cell Tiss. Organ. Cult. 59: 31-38.

Prakash S, Elangomathavan R, Seshadri S, Kathiravan K, Ignacimuthu S (2004). Efficient regeneration of Curcuma amada Roxb. plantlets from rhizome and leaf sheath explants. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 78: 159-165.

Putalun W, Luealon W, De-Eknamkul W, Tanaka H, Shoyama Y (2007). Improvement of artemisinin production by chitosan in hairy root cultures of Artemisia annua L. Biotechnol Lett. 29: 1143-1146.

Sanchez-Sampedro MA, Ferna´ndez-Ta´rrago J, Corchete P (2005) Yeast extract and methyl jasmonate-induced silymarin production in cell cultures of Silybum marianum (L.) Gaernt. J. Biotech. 119: 60– 69.

Sánchez-Moreno C, Larrauri JA, Saura-Calixto F (1998). A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols. J. Sci. Food Agric. 76: 270–276.

Singleton V, Orthoffer R, Lamuela-Raventos RM (1999). Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 299: 152-175.

Vasil IK, Hildebrandt AC (1966). Growth and chlorophyll production in plant callus tissues grown in vitro. Planta. 68: 69-82.

Zhao J, Guo YQ, Kosaihira A, Sakai K (2004). Rapid accumulation and metabolism of polyphosphoinositol and its possible role in phytoalexin biosynthesis in yeast elicitor-treated Cupressus lusitanica cell cultures. Planta. 219: 121-13. 

Phương Anh
SBC Scientific