1Shereen M. Hosny, 1Gehan Hammad, 2Sherif El Sharbasy and 2Zeinab Zayed

 

1 Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học October về Khoa học và Nghệ thuật hiện đại, Ai Cập

2Phòng thí nghiệm trung tâm về nghiên cứu và phát triển cây chà là, Ai Cập

 

Nghiên cứu này nhằm mục tăng cường tái sinh chồi cây chà là Barhi trên môi trường bổ sung các hợp chất tự nhiên. Các cụm nhỏ từ 2-3 chồi được sử dụng làm mẫu vật và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung ba loại chất tự nhiên ở ba nồng độ khác nhau: 10%, 20%, 30% nước cốt dừa, 1.25g/L, 2.5g/L, 5.0g/L Casein Hydrolysate và chiết xuất nấm men; trên nghiệm thức đối chứng có bổ sung 0.05 BA mg/L, 0.1 NAA mg/L. Kết quả đạt được cho thấy phôi soma thứ cấp được hình thành hiệu quả nhất khi có casein hydrolysate 5.00g/L, nước cốt dừa là thành phần hiệu quả nhất tạo nên sự phát triển vượt trội của các mẫu vật. Chiết xuất nấm men cho kết quả thấp nhất trong các nồng độ được đánh giá. Thực hiện phân tích hóa học các chỉ tiêu Chlorophyll ‘A’ và‘B’, tổng Carbohydrate, Protein, Amino Acid, Phenol và Indole. Nhìn chung, nước cốt dừa 30% và Casein Hydrolysate 2.5g/L cho kết quả tốt nhất, về cả khả năng phản hồi và tái sinh.
 

 

 

Cây chà là (Phoenix dactylifera L., 2n = 2x = 36) là cây ăn quả đơn tính khác gốc, lâu năm, có một lá mầm thuộc họ Cau (Arecaceae) và là một trong những cây trồng lâu đời nhất ở Bắc Phi và Trung Đông [1]. Chủ yếu trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt. Về mặt kinh tế, cây chà là là nguồn thu nhập chính của nông dân địa phương và có liên quan đến ngành công nghiệp tại địa phương đó [2]. Cây chà là đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp bền vững ở những vùng khô hạn và nhiễm mặn [1]. Các phương pháp nhân giống truyền thống cây chà là sử dụng chồi vượt (offshoot) của chúng. Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều bất cập. Các chồi vượt được sinh ra với số lượng có hạn và tỉ lệ sống sót thấp, nhưng lại rất dễ bị sâu hại, vì thế kỹ thuật này được coi là khá khó khăn [3]. Do những hạn chế này trong nhân giống cây chà là, nên nuôi cấy mô tế bào đã trở thành kỹ thuật thay thế hấp dẫn cho việc nhân giống cây này [4]. Tận dụng những thuận lợi để nhân giống cây cái khỏe mạnh, sản xuất ra cây đực có phấn hoa tốt và nhân giống quy mô lớn mà không chịu ảnh hưởng của thời tiết [3].
 

Sau khi chọn mẫu vật cho nuôi cấy mô, các nhà nghiên cứu phải tiến hành khảo sát để tìm ra nhiều hợp chất khác nhau cho việc nhân chồi và rễ cây này. Quan trọng nhất trong số các hợp chất được bổ sung đó là các hợp chất tự nhiên như là chiết xuất từ nấm men, nước cốt dừa, casein hydrolysate, cà phê và dứa [5]. Ảnh hưởng của chiết xuất từ nấm men và các dịch chiết từ thực vật đối với nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu nhiều. Các thành phần không xác định như nước ép hoa trái cây, chiết xuất nấm men và protein hydrolysate thường được sử dụng làm môi trường dinh dưỡng như để so sánh với môi trường dinh dưỡng xác định có vitamin hoặc amino acid, hoặc thậm chí chỉ là những thành phần bổ sung phụ thêm [4]. Kết quả nghiên cứu đã được cải thiện về sự đồng nhất và độ lặp lại của môi trường, đây là khía cạnh quan trọng khi chuẩn bị và sử dụng các hợp chất tự nhiên. Ví dụ, nước cốt dừa và dịch chiết chuối thường được sử dụng làm chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy lan  [6]. Việc sử dụng các hợp chất tự nhiên thay cho các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể làm giảm hoặc loại bỏ đi tính bất định di truyền của thực vật. Các chất bổ sung hữu cơ như là Casein hydrolysate và nước cốt dừa được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo phát sinh phôi ở vài loài thực vật cũng như cây chà là [1].
 

Khi thêm các chất bổ sung hữu cơ phức tạp (COA) vào môi trường nuôi cấy chà là in vitro, kết quả cho thấy đã tăng cường hình thành mô sẹo và thúc đẩy sự phát triển và hình thành phôi soma. COA gây ra sự gia tăng đường kính chồi và làm cho cây con phát triển mạnh nhất trong môi trường có 50.0 hoặc 100 mg/L chiết xuất mạch nha. Nghiên cứu này nhằm xác định ảnh hưởng của syrup chà là lên sự khởi phát phôi soma, El-Khateeb[7] đã tìm ra rằng dịch chiết tự nhiên có thể được sử dụng ở nồng độ 6% thay cho sucrose. Dịch chiết từ mô phân sinh cũng tăng cường tạo phôi soma [8]. Mục tiêu của nghiên cứu này là kiểm tra ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của hợp chất bổ sung tự nhiên như nước cốt dừa, casein hydrolysate và chiết xuất nấm men lên sự tăng cường tạo chồi ở cây chà là in vitro. 

Cây giống: Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm (PTN) Trung tâm về nghiên cứu phát triển cây chà là ở Giza, Ai Cập. Tất cả dụng cụ, vật liệu có sẵn ở PTN, mẫu vật được thu từ cây chà là. Chồi con được sinh ra, được dùng làm mẫu vật ở dạng cụm có từ 2-3 chồi, được phát triển và nuôi dưỡng cho đến giai đoạn ra rễ để quan sát hiệu quả phát triển.
 

Đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất tự nhiên lên sự sinh trưởng chồi: Có 3 hợp chất tự nhiên dùng 3 nồng độ khác nhau là Casein Hydrolysate (CH) 1.25, 2.5 và 5.0 g/L, nước cốt dừa (CM) 10%, 20% và 30%; và chiết xuất nấm men (YE) 1.25, 2.5 và 5.0 g/L. Những chất này được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có dinh dưỡng đặc trưng, thí nghiệm đối chứng được thực hiện thông qua nuôi cấy cùng loại mẫu vật trên cùng môi trường ở cùng điều kiện nuôi chỉ khác là không bổ sung thêm chất  nào khác, kí hiệu là M0.
 

Quy trình nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Môi trường được chuẩn bị bao gồm MS theo Murashige và Skoog [9], có môi trường dinh dưỡng cơ bản và vitamin, 170 mg/L NaH2PO4, 0.4 mg/L Thiamine HCl, 100mg/L Myo-Inositol, 30 g/L Sucrose; pH = 5.8, chia 40 mL môi trường vào lọ nuôi cấy 150 mL trước khi hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 15 Ibs/in2, khoảng 20 phút để khử trùng hiệu quả.
 

Mỗi nghiệm thức nuôi cấy được lặp lại 3 lần. Mỗi lần lặp lại 3 lọ. Mỗi lọ chứa một cụm chồi. Mỗi nghiệm thức đều bố trí thí nghiệm đối chứng, nuôi trong điều kiện ánh sáng 1500 lux khoảng 16 giờ. Sau đó chuyển sang nuôi với chu kì 8 giờ tối, tại 27 ± 2°C trong giai đoạn nhân chồi. Cấy chuyền hai lần đối với mẫu đối chứng và ba lần cho mẫu trên môi trường bổ sung dịch chiết tự nhiên. Tất cả các quá trình đều được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
 

Thu nhận dữ liệu: Sau 2 lần cấy chuyền, dữ liệu về số lượng chồi/cụm, chiều dài chồi/cụm (cm), số lượng phôi thứ cấp/cụm, chồi phát triển vượt trội/cụm, số lượng rễ hình thành và chiều dài rễ/cụm (cm). Dữ liệu về hình thành phôi thứ cấp/cụm và sự phát triển vượt trội/cụm được ghi nhận theo như nghiên cứu của Pottino [10] và Mujib và cộng sự [11].
 

Phân tích hóa học: Mỗi gam mẫu tươi cây chà là Barhi có từ các nghiệm thức nuôi cấy bổ sung hợp chất tự nhiên và mẫu đối chứng được sử dụng làm mẫu phân tích. Các phân tích bao gồm Chlorophyll A và B, theo phương pháp Lichtentaler và Wellburn [12], tổng hàm lượng protein theo phương pháp Bradford [13].
 

Tổng carbohydrate được kiểm tra theo nghiên cứu của Dubois và cộng sự [14]. Tổng amino acid, phenol và indole được phân tích lần lượt theo Bates và cộng sự [15], A.O.A.C [16] và Larsen và cộng sự. 
 

Phân tích Chlorophyll A và B: 1g lá lấy từ các nghiệm thức trong thử nghiệm nồng độ của 3 hợp chất bổ sung và nghiệm thức đối chứng. 25 mL acetol cho vào mỗi mẫu và trộn nhẹ nhàng. Phân tích quand phổ được tiến hành cho Chlorophyll A và B lần lượt tại bước sóng 440 nm và 640 nm. Kết quả được xử lý thông qua một phương trình dự tính trước. 
 

Phân tích protein: sử dụng 1 g khối lượng tươi mẫu, thêm vào 1 mL đệm Tris trong lọ vô trùng. Mẫu được ủ khoảng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung dịch đệm Bradford làm việc được thêm vào là 3 mL. Dung dịch này được phân tích quang phổ UV ở bước sóng 595 nm và sử dụng nước cất khử trùng làm blank.
 

Ước tính tổng Carbohydrate: Việc chuẩn bị mẫu để phân tích tổng carbohydrate thực hiện như chuẩn bị mẫu để xác định amino acid. Ủ cùng điều kiện với amino acid, thể tích khoảng 60 mL. Mẫu được để khô và thêm vào 10 mL isopropanol 10%. 1 mL cồn, 1 mL phenol 5% và 5 mL acid sulfuric được bổ sung vào mẫu và để ủ 15 phút. Phân tích quang phổ và tính toán được thực hiện tương tự amino acid tại bước sóng 490 nm.
 

Phân tích amino acid: Khi phân tích amino acid, đánh giá tương tự được tiến hành trên mẫu có cùng bản chất và trọng lượng, sử dụng 20 mL cồn 80%, mẫu thử được ủ trong bể nước 70oC. Bước này được lặp lại 3 lần khoảng 24 giờ cho đến khi mẫu khô. 10% Isopropanol được thêm vào mẫu đã khô. 1 mL dung dịch mẫu được thêm vào 3 mL nước cất và 1 mL đệm acetate. Hỗn hợp này được ủ khoảng 15 phút trong bể ủ 70oC. 10 mL ethanol 50% được thêm vào và các dung dịch được phân tích dưới cùng điều kiện. 
 

Phân tích Phenol và Indole: 10 mL methanol 80% được thêm vào cùng điều kiện với phân tích protein. Ủ qua đêm, 0.5 mL phenol, 1 mL sodium carbonate và 17.5 mL nước cất được thêm vào mẫu. Mẫu được ủ khoảng 1 giờ và phân tích ở bước sóng 730 nm. Phân tích Indole được thực hiện thông qua thêm 1 mL mẫu vào 4 mL PDAB (Para-Dimethyl-Amino-Benzaldehyde) được ủ 1 giờ ở 40oC. Phân tích quang phổ được thực hiện ở 540 nm. 

Phân tích thống kê: Thí nghiệm nhân tố được thiết kế ngẫu nhiên và dữ liệu được dùng để phân tích phương sai. Sự khác nhau của giá trị dung bình được xác định thông qua việc sử dụng L.S.D test ở mức ý nghĩa 5% theo Smith và cộng sự [18].

Ảnh hưởng của các hợp chất tự nhiên lên nhân giống in vitro cây chà là Barhi được đánh giá thông qua sự phát sinh chồi và rễ. Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa ba nguồn chất bổ sung (casein hydrolysate, nước cốt dừa và chiết xuất nấm men), khi so sánh với mẫu đối chứng. Bảng 1, về số lượng chồi, casein hydrolysate 2.5 g/L và nước cốt dừa 30% cho kết quả cao nhất là 8.667 chồi/cụm; kết quả thấp nhất đối với môi trường có chiết xuất nấm men 5g/L (3.333 chồi/cụm). Khi đánh giá chiều dài rễ (cm), kết quả tốt nhất là ở môi trường có chứa casein hydrolysate 2.5 g/L (0.766 cm/cụm), và nước cốt dừa 30% (0.800 cm/cụm), kết quả này gần như nhau; kết quả thấp nhất là trên môi trường có chiết xuất nấm men 5 g/L (0.200 cm/cụm). Liên quan đến sự phát triển vượt trội, kết quả cao nhất được quan sát thấy trên môi trường có casein hydrolysate 5 g/L (3.6667/cụm), và nước cốt dừa 30% (4.0/cụm); kết quả thấp nhất là trên môi trường có chiết xuất nấm men 5 g/L (1.00/cụm). Những kết quả này cho thấy hiệu quả của casein hydrolysate và nước cốt dừa. Khi kiểm tra các yếu tố khác như phôi thứ cấp, kết quả cao nhất là ở nghiệm thức có casein hydrolysate 5 g/L (10.0 phôi/cụm) và chiết xuất nấm men 2.5 g/L (3.00 phôi/cụm); và kết quả thấp nhất được thấy ở nghiệm thức có chiết xuất nấm men 5 g/L (0.33 phôi/cụm). 

 

Bảng 1. Ảnh hưởng của các hợp chất tự nhiên lên số lượng chồi, chiều dài chồi, chồi phát triển vượt trội, phôi thứ cấp, số lượng và chiều dài rễ
 

Nghiệm thức	Nồng độ	Số lượng chồi	Chiều dài chồi (cm)	Chồi phát triển vượt trội	Phôi thứ cấp	Số lượng rễ	Chiều dài rễ (cm)
Đối chứng	0.05 BA, 0.1 NAA mg/L	3.333	0.4333	2.33	5.00	2	2.00
Casein Hydrolysate	1.25 g/L	5.333	0.5667	2.667	2.33	2	1.66
	2.5 g/L	8.667	0.7667	3.333	3.66	1.66	1.46
	5 g/L	5.667	0.3000	3.667	10.0	1.33	1.40
Nước cốt dừa	10 %	6.667	0.5000	3.0	2.33	1.66	1.30
	20 %	7.667	0.6667	3.667	2.00	1.33	1.66
	30 %	8.667	0.8000	4.0	2.66	1	1.40
Chiết xuất nấm men	1.25 g/L	5.000	0.3333	2.333	2.667	1.3	0.96
	2.5 g/L	4.000	0.2333	1.333	3.00	0.6	0.93
	5 g/L	3.333	0.2000	1.00	0.33	0.3	0.86
	L S D ở 0.05	3.19	0.3473	0.8679	2.315	0.05	0.06

 

 

 

Hình 1. Hình đại diện cho kết quả ảnh hưởng của các chất tự nhiên lên mẫu: (A) MO mẫu đối chứng, (B) CM1, chứa 10% nước cốt dừa, (C) CM2: 20% nước cốt dừa, (D) 30% nước cốt dừa, (E) YE1, chiết xuất nấm men 1.25 g/L, (F) YE2, chiết xuất nấm men 2.5 g/L, (G) YE3, chiết xuất nấm men 5g/L, (H), casein hydrolysate 1.25%, (I) CH2, casein hydrolysate 2.5 g/L và (J) CH3, casein hydrolysate 5 g/L

Hình 2. Hình đại diện cho kết quả phân tích hóa học, trong đó hình A là chlorophyl A và B; (B) phân tích tổng hydrocarbon; (C) Tổng protein của các mẫu; (D) tổng Amino acid; (E) kết quả tổng phenol và (F) Tổng Indol. Tất cả các phép đo hàm lượng tính theo mg/L. Hình ảnh bao gồm các thành phần khảo sát và nồng độ của chúng. 

 

Số lượng rễ cho thấy kết quả lý tưởng trong môi trường có casein hydrolysate 1.25 g/L (2/cụm) và kết quả thấp nhất là môi trường có chứa chiết xuất nấm men 5 g/L (0.3/cụm). Khi đánh giá chiều dài rễ (cm) kết quả cao nhất là ở môi trường có casein hydrolysate 1.25 g/L và nước cốt dừa 20% (1.66/cụm). Hình 1 thể hiện kết quả đã được ghi nhận trước đây, trong đó casein hydrolysate và nước cốt dừa cho kết quả cao nhất về sự phát triển, điều này biểu hiện khá rõ ràng bởi vì sự sinh trưởng của mẫu khác biệt với mẫu đối chứng cũng như với mẫu trong môi trường có chiết xuất nấm men.
 

Hình 2 là hình ảnh cho quá trình phân tích hóa học các hợp chất cần thiết trong việc xác định sức sống của cây. Kết quả cho thấy giá trị chlorophyl A và B cao nhất trong nghiệm thức có casein hydrolysate 2.5 g/L và chiết xuất nấm men 1.25 g/L, trong khi đó kết quả thấp nhất được ghi nhận ở nghiệm thức chiết xuất nấm men 5 g/L. Dữ liệu trong hình 2 B cho thấy kết quả cao nhất của tổng carbonhydrate được ghi nhận ở nghiệm thức có nước cốt dừa 10%, 20% và casein hydrolysate 5 g/L; kết quả thấp nhất là ở nghiệm thức chiết xuất nấm men 5 g/L. 
 

Kết quả thể hiện trong hình 1 C về hàm lượng tổng protein, đã chỉ ra rằng số liệu cao nhất được quan sát thấy ở nước cốt dừa 10% và casein hydrolysate 5 g/L. Hình 1 D là biểu đồ biểu thị nồng độ của amino acid, trong đó cho thấy nước cốt dừa 30% và casein hydrolysate 5 g/L cho kết quả cao nhất và chiết xuất nấm men 2.5 g/L cho kết quả thấp nhất. Hình 1 E chỉ ra rằng các kết quả đáng kể nhất đối với tổng Phenol thể hiện rõ ràng trong casein hydrolysate 5 g/L và hình 1F khẳng định rằng tổng Indol cao nhất được quan sát thấy trong casein hydrolysate 5 g/L và casein hydrolysate 2.5 g/L, trong khi đó kết quả thấp nhất được thấy ở mẫu có chiết xuất nấm men 5 g/L. 
 

Nghiên cứu này cho thấy các hợp chất tự nhiên có thể kích thích sinh trưởng. Nhân giống in vitro chà là thông qua gián tiếp phát sinh cơ quan hoặc phôi soma cần sử dụng nồng độ tương đối cao của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như 2,4-D hoặc NAA cho quá trình khởi tạo ban đầu [19,20]. Tuy nhiên những auxin này được biết là có liên quan tới sự bất định di truyền ở thực vật [21, 22]. Việc sử dụng các hợp chất tự nhiên thay thế cho các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy có thể làm giảm hoặc loại bỏ đi khả năng bất định di truyền của thực vật. Các chất bổ sung hữu cơ như casein hydrolysate và nước cốt dừa được dùng để gia tăng phát triển mô sẹo tạo phôi và phôi soma trong vài loài thực vật cũng như là chà là [4].
 

Bởi vì thực vật sống lâu năm có thể tạo ra các đột biến thậm chí trong mô phân sinh ngọn và trong vài năm năm cuối đời  sự biến đổi này diễn ra đối với chà là in vitro Barhi, Medjool và Khalas loại giống lùn Dwarfism, làm chậm ra quả hoặc không ra quả [23,25]. Ảnh hưởng của việc sử dụng chiết xuất nấm men và chiết xuất từ thực vật trong nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu nhiều. Môi trường chứa các thành phần không xác định như nước trái cây, chiết xuất nấm men và hydrolysate được sử dụng để thay thế cho các vitamin hoặc amino acid hoặc cho các chất bổ sung khác. Môi trường nuôi cấy nên được chuẩn bị cùng một lần, đối với các vật liệu có thành phần dễ thay đổi cần được hạn chế đến mức có thể, mặc dù có nhiều kết quả cải thiện nhờ vào những thay đổi này [6, 26]. 
 

Nhiều thực vật như Cynbidium pendulum31, Phalaenopsis violacea32 và Paphiopedillum villosum.33, những thông số như chiều dài trung bình chồi (4.72±0.06), hàm lượng Chlorophyll (1.7±0.02), hàm lượng Protein (22.4±0.08) và hàm lượng Carbohydrate (22.5±0.01) được nghiên cứu bởi Sudipta và cộng sự (2013), những kết quả tốt thể hiện khi 10% nước cốt dừa được bổ sung vào môi trường. Tương tự, sử dụng nước cốt dừa  để làm tăng số lượng chồi, chiều dài chồi và số lượng đốt. Liên quan đến số lượng chồi và chiều dài chồi, casein hydrolysate 2.5 g/L và nước cốt dừa 30% cho kết quả cao nhất. Nước cốt dừa chứa hàm lượng protein cao, trong khi đó casein chứa nhiều amino acid và vitamin, điều này chứng tỏ rằng các chất bổ sung tự nhiên này làm tăng sự phân chia tế bào. Hơn nữa, cả nước cốt dừa và casein hydrolate hoạt động như là cytokinin, vì vậy chúng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của chồi. Những kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Beshir và cộng sự [15] trong đó nước cốt dừa làm sinh nhiều chồi nhất và chồi cũng dài nhiều nhất (5,10, 20 cm). Duhamet và Gautheret [26] diễn đạt rằng nước cốt dừa thường được sử dụng như là chất kích thích sự phân chia tế bào, điều này là bởi vì hàm lượng amino acid cao có trong nước cốt dừa .

Các kết quả cho thấy khi nồng độ nước cốt dừa tăng thì số lượng và chiều dài chồi tăng. Kết quả này giống với nghiên cứu của  Baque và cộng sự [27], điều này cho thấy sự gia tăng nồng độ nước cốt dừa (10 đến 50 mL/L) trong môi trường nuôi cấy, làm gia tăng chiều dài chồi, số lượng và diện tích lá. Nồng độ cao nhất 50 mL/L nước cốt dừa làm tăng cường sự phát triển của cây con khi đem so sánh với cácnghiệm thức đối chứng.
 

Khi đánh giá sự hình thành phôi thứ cấp, casein hdrolysate 5 g/L cho hiệu quả tốt nhất. Điều này là bởi vì hàm lượng amino acid cao trong casein hydrolysate dẫn đến gia tăng phân chia tế bào. Điều này trùng hợp với nghiên cứu của Pelegrini [28], trong đó tỉ lệ cao nhất của phôi soma thứ cấp là 8.3% được quan sát thấy trên môi trường WPM chứa 1 g/L casein hydrolysate và sự phát triển của phôi soma cũng diễn ra ở đây.
 

Chiết xuất nấm men cho kết quả thấp nhất về số lượng và độ dài chồi, rễ khi so sánh với mẫu đối chứng, cũng như với các nghiệm thức nước cốt dừa và casein hydrolysate. Chiết xuất nấm men cũng cho kết quả thấp nhất về phát triển vượt trội. Điều này chứng tỏ rằng chiết xuất nấm men không có ảnh hưởng nhiều lên sự phát triển của cây. Theo Abraham và cộng sự [29], chiết xuất nấm men được sử dụng như là chất bổ sung trong môi trường sinh trưởng, nhưng không có ảnh hưởng đến sinh trưởng chồi đối với cây  C.mangga. in vitro.
 

Những kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Zaid và De Wet, trong đó báo cáo rằng nồng độ của nước cốt dừa (50.0, 100.0 và 150.0 mg/L) và chiết xuất mạch nha (100.0 mg/L) có ảnh hưởng đến sự phát triên và gia tăng phôi soma thứ cấp, trong khi casein hydrolysate lại không ảnh hưởng. Dữ liệu ghi nhận cho thấy số lượng trung bình chồi cao nhất khi có nước cốt dừa thêm vào môi trường nảy chồi (3.77 mg/L). Bổ sung các chất tự nhiên làm tăng tỉ lệ nhân giống in vitro. Sự phát triển in vitro và tái sinh cây có thể được cải thiện khi thêm một lượng nhỏ các chất dinh dưỡng hữu cơ vào môi trường [30]. Nước cốt dừa, chiết xuất từ nội nhũ cứng, màu trắng của quả dừa trưởng thành, cũng được sử dụng để làm tăng trưởng và khởi phát hình thái mà không cần đến các chất có công thức xác đinh [31].
 

Phân tích hóa học được sử dụng khảo sát ảnh hưởng của các chất bổ sung thiên nhiên lên sự trao đổi chất bên trong tế bào thực vật. Nasib và cộng sự [32] báo cáo rằng môi trường có 10% nước cốt dừa làm phát triển mạnh hơn. Trong nghiên cứu này, các sản phẩm chlorophyl A tốt nhất được sản sinh khi có casein hydrolysate 2.5 g/L bởi vì trong môi trường này tạo ra số lượng và chiều dài chồi nhiều nhất. Chiết xuất nấm men 1.25 g/L cho kết quả chlorophyl B tốt nhất, ngoài sự mong đợi. Những kết quả này cho thấy không có sự liên quan giữa chiề dài và tỉ lệ chlorophyl trong lá.
 

Carbohydrate được xem như là nhiên liệu của quá trình trao đổi chất và hô hấp tế bào. Sau khi phân tích hàm lượng carbohydrate trong cây, cho kết quả cao nhất trong nước cốt dừa 20% và 30%, casein hydrolysate 5 g/L. Điều này là bởi vì hàm lượng protein và carbohydrate cao, trong 240 g sinh khối có 13.3 g carbohydrate. Hình 2B cho thấy mối tương quan giữa nồng độ nước cốt dừa và casein hydrolysate với tổng carbohydrate, trong đó cả hai chất này được xác định như là thành phần tác động trực tiếp. Bên cạnh những hiểu biết về sự nổi bật của carbohydrate đối với tế bào nhân thực, thì những kết quả này cho thấy vai trò của nước cốt dừa và casein hydrolysate trong tăng cường phát triển cây. Theo Sudipta và cộng sự [33], tổng hàm lượng carbohydrate (22.5±0.01) được tìm thấy trong môi trường có 10% nước cốt dừa, điều này cho những phản hồi tích cực cho nghiên cứu. Liên quan đến sự hiện diện của protein, 10% nước cốt dừa cho kết quả tốt nhất bởi vì có 5g protein trong mỗi 240 g sinh khối. Sudipta và cộng sự [33] cũng có kết quả tương tự (22.4±0.08) trong môi trường có 10% nước cốt dừa. Bởi vì hàm lượng amino acid trong casein hydrolysate cao, dẫn đến kết quả cao nhất có trong khoảng 5 g/L. Nước cốt dừa cũng cho kết quả cao nhất khoảng 30% và được cho là do hàm lượng protein cao. Amino acid đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển của sinh vật bao gồm cả thực vật; một lượng lớn chất này trong sinh vật biểu thị cho sức sống và sự sẵn sàng cho phát triển về sau.
 

Mặc dù casein hydrolysate 5 g/L cho kết quả cao nhất (0.06 mg/g),  nhưng giá trị này vẫn không đáng kể. Kết quả thấp trong phân tích phenol cho thấy các chất bổ sung tự nhiên có lợi cho mẫu Barhi in vitro và làm  mẫu có thể tiếp tục phát triển. Casein hydrolyaste 2.5 g/L và 5 g/L cho kết quả hàm lượng Indol cao nhất. Hai chất này có liên quan trực tiếp với nhau, có sự hiện diện của Indole trong casein hydrolysate .
 

Phân tích này chứng minh cho lý do tại sao casein hydrolysate lại cho kết quả số lượng và chiều dài rễ cao nhất như vậy, nhất là khi casein hydrolysate ở nồng độ 1.25 g/L. Indole là tiền chất cho IAA (Indole-3-Acetic acid), một loại auxin giúp hình thành và phát triển rễ. Chiết xuất nấm men cho thấy có mối quan hệ tỉ lệ nghịch với indole, vì thế mà cho kết quả thấp nhất về số lượng và chiều dài rễ; nghiên cứu của McCubbin và cộng sự [24] cũng đã xác nhận kết quả này.
 

Kết luận, hạn chế và nghiên cứu tiếp theo: Nhìn chung nghiên cứu này đã cho thấy một kết quả  thuyết phục trong việc bổ sung các hợp chất tự nhiên vào môi trường nuôi cấy như là chất điều hòa sinh trưởng,  đáp ứng yêu cầu sinh trưởng. Nước cốt dừa 30% và casein hdrolysate 2.5 g/L là chất cảm ứng thành công nhất và phù hợp cho nuôi cấy in vitro cây chà là Barhi (Phoenix Dactylifera L.). Hàm lượng tổng phenol có kết quả thấp trong các mẫu cho thấy một xác suất cao cho sự phát triển về sau của mẫu chà là Barhi in vitro trên môi trường MS có bổ sung các hợp chất tự nhiên (nước cốt dừa, casein hydrolysate và chiết xuất nấm men). Nghiên cứu này đã đạt được các kết quả thành công, tuy nhiên, cần đánh giá ở các khoảng nồng độ rộng hơn để có thể cung cấp nhiều kết quả ý nghĩa hơn và cho phép thực hiện các kỹ thuật phân tích thống kê khác để đánh giá hiệu quả mà không thể thực hiện đối với các thí nghiệm hiện tại. Quá trình thích nghi và phân tích thực địa cũng cho thấy những lợi ích đáng kể hơn. 

Cảm ơn toàn thể nhân viên của PTN trung tâm về nghiên cứu và phát triển cây chà là vì những nổ lực đáng trân trọng trong việc hỗ trợ nghiên cứu này và cũng là những người nghiên cứu chính. Cảm ơn Tiến sĩ Gehan Safwat đã cung cấp cơ hội thứ hai để thực hiện dự án và sự hướng dẫn đáng quý của tiến sĩ. 

1. Khierallah, H.S.M. and N.H. Hussein, 2013. The Role of coconut water and casein hydrolysate in somatic embryogenesis of Date Palm and genetic stability etection using RAPD markers. Date Palm Research Unit, College of Agriculture, University of Baghdad, Iraq.

2. Jain, S.M., J.M. Al-Khayri and D.V. Johnson, 2011. Date Palm Biotechnology” Springer Dordrecht Heidelberg London New York, Department of Agricultural Sciences, University of Helsinki, Finland.

3. Zaid, A. and P.F. De Wet, 2002. Date Palm and P.A. Rebers, Propagation, in: Zaid, A., ed., Date Palm Cultivation FAO Plant Production and Protection Paper no. 156, Food and Agriculture Organization of the United 15 Nations, Rome, pp: 29-44.

4. Al Khayri, J.M., 2010. Somatic embryogenesis of  Date Palm Improved by coconut water. Department of Agriculture Biotechnology, College of Agriculture 

5. Food Science, King Faisal University, Al Hassa, D.C., U.S.A. Saudi Arabia.

6. George, F.E., 1993. Plant tissue Technique, The Components of Culture Media, Printed  in the UK by Butler and Tanner  Ltd, Frome Somerset, 273

7. El-Khateeb, A.A.,  2008. Comparison effects of Somatic sucrose and Date Palm syrup on  and immature embryogenesis  of  Date  Palms Phoenix Dactylifera Barhee. L., Am. J. Biotech Biochem, 4(1): 9-23.

8. El Assar, A.M., W.M. El Messeih and M.R.  El- Shenawi, 2004. Applying some  natural  extracts and growth regulators to culture media and their effect on Sewi  cv.  Date  Palm  tissue  growth  in vitro. Assiut Journal of Agricultural Science,  34(4): 155-168.

9. Murashige,  T.and F.A. Skoog,  1962. A  Revised medium for rapid growth and bioassays   with Tobacco    tissue cultures. Physiology  Planterum, 15: 473-497

10. Pottino, B.G., 1981. Methods in Plant Tissue Culture, Department   of   Horticulture, Agricultural  College Maryland Univ. College Park, Maryland, USA, 8-29.

11. Mujib, A., S. Banergee and P.D. Ghosh, 2005. Origin, development and structure of somatic embryos in selected bulbous ornamentals: BAP as Inducer, In: Mujib, A. and Samaj, J. (eds.): Somatic Embryogenesis, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 15-24.

12. Lichtenthaler, H.K. and A.R. Wellburn, 1985. Determination of total carotinoids and chlorophyll A and B of leaf in Different Solvents. Biol. Soc. Trans., 11: 591-592.

13. Bradford,  M.M.,  1976. A Dye Binding Assay for Protein. Anal. Biochem., 72: 248-254.

14. Dubois, M., F. Smith, K.A. Gilles, J.K. Hamilton and P.A. Rebers, 1956. Colorimetric Method forDetermination of Sugars and Related Substances Annal. Chem., 28(3): 350-356.

15. Bates,  L.S., R.P. Waldern and I.D. Tear, 1973. Rapid determination of free proline under water stress studies. Plants and Soil, 39: 205-207.

16. A.O.A.C., 1980. Association of Official Agriculture Chemists Official Method of Analysis, Washington, D.C., U.S.A.

17. Larsen, P.,  A. Harbo,  S. Klungroun  and  T.  Ashein, 1962. On the biogenesis of some Indole compounds, in: Acetobacter xylinum. Physiol Plant., 15: 552-565.

18. Smith, P.K., R.L. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gartner, W. Snedekor and W. Cochran, 1980. Statistical Methods, 7th ed., Iowa State Univ. Press, Ames, Iowa, USA.

19. Tisserat, B., 1979. Propagation of Date Palm (Phoenix Dactylifera L.) in vitro. J.of Exp. Botany 30:119: 1275-1283.

20. Bhaskaran, S. and R.H. Smith, 1992. Somatic embryogenesis from shoot tip and inflorescence of (Phoenix dactylifera L.) CV Plant Cell Rep., 12: 22-25.

21. Phillips, R.L., S.M. Kaeppler and P. Olhoft, 1994. Genetic instability of plant tissue culture: Breakdown of Normal Control. Proceeding of the National Academy of Science USA. 91: 5222-5226.

22. Cullis, C.A., 1999. Environmental stress- A generator of adaptive variation, In: Lerner, H.R. (Ed). Plant Adaptation to Stress Environments’, Marcel Dekker, New York, pp: 149-160.

23. Klekowski, E.J., 1985. Mutations, apical cells and vegetative reproduction. Proceedings of the Royal Society of Edinburgh. Section B. Biological Sciences pp: 67-73.

24. McCubbin, M.J., A. Zaid  and  J.  Van  Staden,  2004. A southern african survey conducted for off- types on date palm produced using somatic embryogenesis. Emir.J.Agric.Sci., 16(1): 8-14.

25. Al-Kaabi, H.H. ,A.Zaid, H. Shephard and C. Ainsworth, 2007. AFLP variation in   tissue culture-derived  Date Palm (Phoenix Dactylifera L.) plants. Acta Hort., 736: 135-159.

26. Duhamet,  L.  and  R.G.  Gautheret, 1950. Structure Anatomique de Fragments de Tubercules de Topinambour Cultives en Presence de Lait de Coco. Comp. Rendus de la Soc. de Biol.,  144: 177-184.

27. Baque,  A.,  Y.K. Shin, T. Elshmari, E.J. Lee and K.Y. Pack, 2011. Effect of light quality, sucrose and coconut water concentration on the micropropagation of canthe hybrids. Australian Journal of  Crop Science, 5(10): 1247-1254.

28. Pelegrini, L.L., L.L. Ribas, E. Amano and  M. Qoirin, 2013. Somatic embryogenesis and morphoanatomy of Ocotea porosa  somatic embryos. Ciencia Florestal, Sanata Maria, 24(4): 595-605.

29. Abraham, F., A. Bhatt, C.L. Keng, G.  Indrayanto and S. Sulaiman, 2011. Effect of yeast extract and chitosan on shoot proliferation, morphology and antioxidant activity of curcuma mangga in vitro plantlets. African Journal of Biotechnology, 10(40): 7787-7795.

30. Neumann, K.H., A. Kumar and J. Imani, 2009. Plant  cell and tissue culture – A Tool in biotechnology, basics and applications. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.

31. Thorpe, T.A., C. Stasolla, E.C. Yeung, G.J. de Klerk, A. Roberts and E.F. George, 2008. The Components of Plant Tissue Culture Media II: Organic Additions, Osmotic  and  pH  Effects  and  Support  Systems, In: George, E.F., Hall M.A., de Klerk G-J., eds., Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd. ed., Vol. 1, The Background, Springer-Verlag, Dordrecht, pp: 115-173.

32. Nasib,  A.,  K.  Ali and S. Khan, 2008. An Optimized and  improved method for the  in vitro  propagation of Kiwifruit (Actinidia deliciosa) using coconut water. Pak. J. Bot., 40: 2355-2360.

33. Sudipta, K.M., M. Kumara Swamy and M. Anuradha, 2013. Influence of Various Carbon Sources and Organic Additives  on In vitro Growth andMorphogenesis of Leptadenia reticulata (Wight & Arn), A Valuable Medicinal Plant of India. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 21(2), Jul – Aug 2013; n32, 174-179.

Khải Mùi
SBC Scientific